[發明專利]一種提高馬爾尼菲籃狀菌基因敲除轉化率的方法

在審

• 申請號: 201910544866.1
• 申請日: 2019-06-21
• 公開（公告）號: CN110295119A
• 公開（公告）日: 2019-10-01
• 發明（設計）人: 曹存巍;廖萬清;鄭艷青;羅宏;潘開素
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12R1/80
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 韋錦捷

本發明公開了一種提高馬爾尼菲籃狀菌基因敲除轉化率的方法，涉及生物技術領域。所述方法包括步驟：(1)馬爾尼菲籃狀菌菌體制備；(2)原生質體制備；(3)原生質體轉化；(4)原生質體復生；步驟(2)采用一種新的破壁酶與菌體混合，對菌體細胞壁進行溶解消化1.5?2h；步驟(4)將轉化后的原生質體用STC緩沖液重懸，加入含有1?1.5mol/L山梨醇的SD培養液基，并于23?28℃搖床80?120rpm/min震蕩培養1?2天恢復生長，之后將孢子懸液接種至ANM?U固體培養基中，篩選陽性轉化子，完成克隆篩選。通過以上方法能夠提高基因轉化效率，為馬爾尼菲籃狀菌基因功能研究提供堅實保障。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種馬爾尼菲籃狀菌基因敲除新方法。

背景技術

馬爾尼菲籃狀菌病流行于我國南方和東南亞地區，是其流行地區艾滋病患者最常合并的機會性感染之一，據報道廣西19％艾滋病患者合并馬爾尼菲籃狀菌感染，死亡率高達80％，是導致當地艾滋病患者死亡的重要因素。近年來，由于免疫抑制劑的廣泛使用，沒有明顯免疫缺陷的病人感染馬爾尼菲籃狀菌的頻率越來越高。但是，國內外對馬爾尼菲籃狀菌的致病機理知之甚少。

基因敲除技術是研究馬爾尼菲籃狀菌感染機制、免疫逃逸機制和基因功能研究的基礎，馬爾尼菲籃狀菌細胞壁堅固難以消化；且原生質體長時間暴露菌體外易損傷、在固體培養基中易破碎、難以成活等，導致該方法轉化效率不高，如何在短時間內提高馬爾尼菲籃狀菌原生質體的制備效率以及促進基因轉化后的成活成為關鍵的技術問題。國內現有的原生質體轉化法基因敲除技術，使用的酶解液(包涵纖維素酶、蝸牛酶、溶菌酶)配制復雜且不易保存，破壁時間需要4-6小時，花費時間長，不易于原生質體再生。在基因轉化后，現有轉化方法直接將懸液在固體培養基上涂板，容易形態失衡破裂，導致復生率下降。

發明內容

為了至少解決上述技術問題之一，提高馬爾尼菲籃狀菌原生質體的制備效率，促進基因轉化后的成活，本發明旨在提供一種新的馬爾尼菲籃狀菌基因敲除方法。

本發明采取的技術方案如下：

一種提高馬爾尼菲籃狀菌基因敲除轉化率的方法，包括步驟：(1)馬爾尼菲籃狀菌菌體制備；(2)原生質體制備；(3)原生質體轉化；(4)原生質體復生；

所述的步驟(2)，采用破壁酶Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum與馬爾尼菲籃狀菌菌體混合，對馬爾尼菲籃狀菌菌體的細胞壁進行溶解消化1.5-2h；

所述的步驟(4)，將轉化后的原生質體用STC緩沖液重懸，加入含有1-1.5mol/L山梨醇的SD培養液基，并于23-28℃搖床80-120rpm/min震蕩培養1-2天恢復生長，之后將孢子懸液接種至ANM-U固體培養基中，篩選陽性轉化子，完成克隆篩選。

作為優選，所述的一種提高馬爾尼菲籃狀菌基因敲除轉化率的方法，具體包括以下步驟：

(1)馬爾尼菲籃狀菌菌體制備：取馬爾尼菲籃狀菌孢子液轉移至SD+U培養基中，37℃搖床200rpm/min震蕩40小時；收集菌體，用濃度為0.6mol/L的MgSO₄溶液洗滌1-2次，最后用5-10ml OSMO重懸。

(2)原生質體制備：取破壁酶Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum至燒瓶，用1-3ml OSMO緩沖液溶解，將重懸的馬爾尼菲籃狀菌菌體轉移至燒瓶中與破壁酶混合，在30℃、200rpm/min的條件下消化1.5-2h；收集原生質體，加入STC，吹打均勻，在4℃、4500rpm/min條件下離心收集10min，洗滌兩次；底部沉淀用STC溶解，按照每100ul原生質體加入25ul的量加入40％PTC，并吹打均勻，得原生質體混合液。