[發明專利]一種提高馬爾尼菲籃狀菌基因敲除轉化率的方法

在審

• 申請號: 201910544866.1
• 申請日: 2019-06-21
• 公開（公告）號: CN110295119A
• 公開（公告）日: 2019-10-01
• 發明（設計）人: 曹存巍;廖萬清;鄭艷青;羅宏;潘開素
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12R1/80
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 韋錦捷

1.一種提高馬爾尼菲籃狀菌基因敲除轉化率的方法，包括步驟：(1)馬爾尼菲籃狀菌菌體制備；(2)原生質體制備；(3)原生質體轉化；(4)原生質體復生；其特征在于：

所述的步驟(2)，采用破壁酶Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum與馬爾尼菲籃狀菌菌體混合，對馬爾尼菲籃狀菌菌體的細胞壁進行溶解消化1.5-2h；

所述的步驟(4)，將轉化后的原生質體用STC緩沖液重懸，加入含有1-1.5mol/L山梨醇的SD培養液基，并于23-28℃搖床80-120rpm/min震蕩培養1-2天恢復生長，之后將孢子懸液接種至ANM-U固體培養基中，篩選陽性轉化子，完成克隆篩選。

2.根據權利要求1所述的提高馬爾尼菲籃狀菌基因敲除轉化率的方法，其特征在于：所述的步驟(2)的具體方法為：

取破壁酶Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum至燒瓶，用OSMO緩沖液溶解，將收集到的馬爾尼菲籃狀菌菌體轉移至燒瓶中與破壁酶混合，在30℃、200rpm/min的條件下消化1.5-2h；收集原生質體，加入STC，吹打均勻，在4℃、4500rpm/min條件下離心收集10min，洗滌兩次；底部沉淀用STC溶解，按照每100ul原生質體加入25ul的量加入40％PTC，并吹打均勻，得原生質體混合液。

3.根據權利要求1所述的提高馬爾尼菲籃狀菌基因敲除轉化率的方法，其特征在于：所述的步驟(4)的具體方法為：

將轉化后的原生質體用STC緩沖液重懸，加入含有1.2mol/L山梨醇的SD培養液基，并于23-28℃搖床80-120rpm/min震蕩培養1-2天恢復生長，之后將孢子懸液接種至ANM-U固體培養基中，篩選陽性轉化子，完成克隆篩選。

4.根據權利要求1所述的提高馬爾尼菲籃狀菌基因敲除轉化率的方法，其特征在于：所述的步驟(3)的具體方法為：

取原生質體混合液加入到含DNA的離心管中，拍打均勻，碎冰孵育20-30min；將混合液取出加入40％PTC，拍打均勻，置室溫20-30min；加STC緩沖液，顛倒混勻，在4℃、6000rpm/min條件下離心5min。

5.根據權利要求1所述的提高馬爾尼菲籃狀菌基因敲除轉化率的方法，其特征在于：所述的步驟(1)的具體方法為：

取馬爾尼菲籃狀菌孢子液轉移至SD+U培養基中，37℃搖床200rpm/min震蕩40小時；收集菌體，用濃度為0.6mol/L的MgSO₄溶液洗滌，重懸。

6.根據權利要求1-5任意一項所述的方法在馬爾尼菲籃狀菌原生質體基因轉化上的應用。