[發明專利]DiI染料標記示蹤子宮上皮細胞來源外泌體的方法

在審

• 申請號: 201910544787.0
• 申請日: 2019-06-21
• 公開（公告）號: CN110618002A
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 譚強;施爽;褚玲娜;邱寒峰;王爭光
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N21/64
• 代理公司: 33246 浙江千克知識產權代理有限公司
• 代理人: 冷紅梅

本發明目的是提供一種不改變外泌體結構和組成成分，不影響外泌體生物功能的利用DiI染料標記、示蹤子宮上皮細胞來源外泌體的方法。所述方法包括：將外泌體加入10～30nM的DiI染料中37℃孵育30min后，離心，去除多余的染料，所得外泌體用PBS重懸，得到標記后的外泌體。本發明的有益效果主要體現在：本發明標記方法改變外泌體結構和組成成分，不影響外泌體生物功能，可對胚胎滋養層細胞攝取子宮上皮細胞來源外泌體過程進行準確示蹤，有助于對外泌體的功能進行進一步的研究。

(一)技術領域

本發明涉及DiI染料標記、示蹤子宮上皮細胞來源外泌體的方法。

(二)背景技術

DiI即DiIC18(3)，全稱為1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，分子式為C₅₉H₉₇ClN₂O₄(結構如式(I)所示)，分子量為933.88，CAS number為41085-99-8。DiI可以溶解于無水乙醇、DMSO和DMF，其中在DMSO中的溶解度大于10mg/ml。是最常用的細胞膜熒光探針之一，呈現橙紅色熒光。DiI是一種親脂性膜染料，進入細胞膜后可以側向擴散逐漸使整個細胞的細胞膜被染色，DiI和磷酯雙層膜結合后的激發光譜和發射光譜參見圖1。DiI在進入細胞膜之前熒光非常弱，僅當進入到細胞膜后才可以被激發出很強的熒光。DiI被激發后可以發出橙紅色的熒光，最大激發波長為549nm，最大發射波長為565nm。試劑4℃避光保存，一年有效。配制的儲存液-20℃避光保存，半年有效。

胞外囊泡(Extracellular vesicles，Evs)是由細胞產生的，分泌到細胞外部的發揮細胞通訊作用的脂質雙分子層結構。根據囊泡直徑大小，分為外泌體、微泡和凋亡小體。外泌體直徑約為40～200nm，是一種重要的細胞遠端通訊的方式，幾乎所有類型的細胞都能夠分泌產生外泌體，包括癌細胞、上皮細胞、脂肪細胞等。在生物體液中，也鑒定發現了外泌體，例如血液、尿液、腦脊液等。外泌體之所以具有重要的細胞通訊作用，是因為外泌體中包裝有大量宿主細胞來源的分子，例如蛋白質、mRNA/miRNA和DNA等物質。

隨著細胞生物學和醫學前沿交叉領域的不斷發展，外泌體的研究逐漸深入，越來越多的研究證明外泌體在疾病治療中展現出令人振奮的治療效果。但在利用外泌體進行治療前，首先要闡明外泌體在體內的生物分布和在細胞中的最終命運。所以迫切需要一種標記方法實現對外泌體體外標記和活體示蹤，從而實現在不影響其功能的前提下可視化外泌體，有助于對外泌體的功能進行進一步的研究。

目前為止已有多種標記外泌體的方法，但是都存在一定的缺陷，主要表現在破壞外泌體的膜結構、改變外泌體的組成成分、影響外泌體的功能等。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種不改變外泌體結構和組成成分，不影響外泌體生物功能的利用DiI染料標記、示蹤子宮上皮細胞來源外泌體的方法。

本發明采用的技術方案是：

DiI染料標記外泌體的方法，所述方法包括：將外泌體加入10～30nM的DiI染料中37℃孵育30min后，離心，去除多余的染料，沉淀外泌體，所得外泌體用PBS重懸，得到標記后的外泌體；所述外泌體與DiI染料質量用量之比為：40～60:1。

優選的，所述外泌體為子宮上皮細胞(如Ishikawa細胞或HEC-1-A細胞等)來源的外泌體。

本發明還涉及一種利用所述DiI染料標記外泌體，對胚胎滋養層細胞攝取子宮上皮細胞來源外泌體過程進行示蹤的方法，所述方法包括：

(1)將子宮上皮細胞來源外泌體與10～30nM的DiI染料37℃孵育30min；