[發明專利]一種增強成骨細胞能力的牦牛膠制備方法

在審

• 申請號: 201910543375.5
• 申請日: 2019-06-21
• 公開（公告）號: CN110229863A
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發明（設計）人: 杜玉枝;楊紅霞;肖遠燦;李岑;畢宏濤;張明;魏立新
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北高原生物研究所
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K14/78;C07K14/47;A61P19/10
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 李艷華

本發明涉及一種增強成骨細胞能力的牦牛膠制備方法，包括以下步驟：⑴將新鮮帶毛的青藏高原牦牛皮清洗干凈，經紫外燈照射，得到輻照后的牦牛皮；⑵輻照后的牦牛皮切塊，沸水中提取后取出，用多刺板刺穿牦牛皮；⑶將步驟⑵所得的牦牛皮放入1%~10%的酶解液中酶解，過濾，分別得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液；⑷酶解后的牦牛皮中加入水煮沸，得到濾液；⑸濾液中加入活性炭，充分攪拌后靜置過濾，得到濾渣；⑹濾渣放入0.5%~8%的酶解液中酶解，過濾，得到第二次酶解溶液；⑺將兩次酶解溶液合并后煮沸，經離心分離，得到上清液；⑻上清液采用串聯式膜分離，截取分子量為72~130 kDa的牦牛皮Ⅰ型膠原和角蛋白，經冷凍干燥，即得牦牛膠。本發明方法簡單，易于實施。

技術領域

本發明涉及Ⅰ型膠原和角蛋白的制備工藝，尤其涉及一種增強成骨細胞能力的牦牛膠制備方法。

背景技術

成骨細胞起源于多能的骨髓基質中的間充質干細胞，是骨形成的主要功能細胞，具有骨基質的合成、分泌和礦化功能。成骨細胞在體外培養系統中要經歷細胞增殖、細胞外基質成熟和基質礦化3個時期。Ⅰ型膠原蛋白（Col－Ⅰ）和一些非膠原蛋白是成骨細胞分化的標記物，能反映成骨細胞分化表型特征。成骨細胞可被不同種類的激素及生長因子激活，刺激DNA和膠原的合成(Aronow等，1990)。成骨細胞是體內造血誘導微循環的重要成分，可表達多種黏附分子。

Col－Ⅰ是由成骨細胞分泌且受力學調控的一種最基本的基質蛋白。在骨折愈合過程中，Col－Ⅰ通過酶介導方式起到抵抗組織應變的作用，從而增強骨強度。當成骨細胞處于礦化階段時，Col－Ⅰ，OCN與OPN等基因表達水平達到峰值，細胞外基質成熟后形成鈣沉積，成骨細胞被包埋其中形成骨組織。

Col－Ⅰ對維持骨結構的完整及骨生物力學特性非常重要。骨質疏松癥是以低骨量、微結構改變、骨脆性增加為特點的全身性代謝性骨病。膠原，尤其是Col－Ⅰ結構及數量的改變與骨質疏松癥發生、發展、嚴重程度密切相關。Col－Ⅰ構成結締組織的骨架，在祖細胞形成新骨過程中具有重要作用。

角蛋白具有獨特的分子結構，并具有可降解性和生物相容性，與骨骼有很好的親和力，胱氨酸和極性氨基酸含量高。牛毛主要是由角蛋白組成，具有氨基酸長鏈，角蛋白類似于膠原，有兩種主要蛋白，一種為含硫元素較多的細胞間質蛋白，含有胱氨酸；另一種為含硫較少的纖維質蛋白。胱氨酸是一種含硫氨基酸，多含于角蛋白中，是人體必需的氨基酸之一，對人體沒有不良效果。醫藥上有促進機體細胞氧化和還原機能，增加白血球和阻止病原菌發育等作用，也用于痢疾、傷寒、流感等急性傳染病、氣喘、神經痛、濕疹以及各種中毒疾患等，并有維持蛋白質構型的作用。

骨髓基質細胞起源于胚胎發育的間充質干細胞，是成體骨髓中的一類多能干細胞，具有多向分化潛能，并具有分化成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和其他幾種結締組織細胞的潛能。

牦牛是青藏高原特有牛種，目前，對于牦牛皮的研究一直是以脫毛后的皮進行，忽略了牦牛毛的作用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種方法簡單、易于實施的增強成骨細胞能力的牦牛膠制備方法。

為解決上述問題，本發明所述的一種增強成骨細胞能力的牦牛膠制備方法，包括以下步驟：

⑴將新鮮帶離皮1~2厘米毛的青藏高原牦牛皮清洗干凈，經紫外燈照射，得到輻照后的牦牛皮；

⑵所述輻照后的牦牛皮切割成1~3cm的塊，沸水中提取5~30分鐘后取出，用多刺板刺穿牦牛皮；

⑶將所述步驟⑵所得的牦牛皮放入質量濃度為1%~10%的酶解液中酶解，過濾，分別得到酶解后的牦牛皮和第一次酶解溶液；所述牦牛皮與所述酶解液的質量比為1：10~1：20；

⑷所述酶解后的牦牛皮中加入其質量8~15倍的水煮沸5~40分鐘，得到濾液；