[發明專利]ND4基因重組腺相關病毒載體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201910542807.0
• 申請日: 2019-06-21
• 公開（公告）號: CN112111515A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 李斌
• 申請（專利權）人: 武漢紐福斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N5/10;C07K19/00;A61K48/00;A61K38/44;A61P27/02
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 王衛彬;黃益澍

本發明公開了一種包含ND4基因表達盒的重組腺相關病毒載體，所述重組腺相關病毒載體的骨架為pAAV9，所述ND4基因表達盒包含人ND4基因或優化的人ND4基因。本發明還公開了該重組腺相關病毒載體的制備方法和應用。本發明將pAAV9作為ND4的基因載體，將ND4轉導至病人眼中時，在確保安全性的同時，在視網膜上的表達量更高，具有更高的轉導效率和高效的表達能力，感染視神經細胞的能力更強。將其制備為玻璃體腔注射的藥物，能夠增強該基因在Leber’s基因治療中效果，并且可以減少注射劑量和縮短治愈時間。

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，尤其涉及一種ND4基因重組腺相關病毒載體及其制備方法和應用。

背景技術

Leber遺傳性視神經病變(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一種主要累及黃斑乳頭束纖維，導致視神經退行性變的線粒體遺傳性疾病。本病好發于青中年男性，臨床表現為雙眼同時或先后急性或亞急性無痛性視力減退，同時可伴有中心視野缺損及色覺障礙。

LHON由線粒體位點突變引起，我國學者已初步確認中國95﹪以上的LHON患者分別與線粒體DNA中11778、14484和3460的位點突變有關，其中11778位點突變最常見，占我國LHON的89.2％，且預后最差。線粒體DNA的11778位點突變的發病機制是，線粒體DNA(mtDNA)第11778位的核苷酸發生突變引起的，即鳥嘌呤(G)→腺嘌呤(A)，此突變使呼吸鏈上NADH脫氫酶亞單位4中(ND4)基因編碼的第340位氨基酸由精氨酸變為組氨酸。雖然它們均為堿性氨基酸，但這一位置的精氨酸是高度保守的。由于突變可能降低電子流動效率影響酶的活性從而減少視神經細胞ATP的產生，細胞逐漸凋亡，從而導致患者發生LHON。

LHON目前尚無方法治療，是世界公認的青少年致盲眼病之一，隨著基因治療的發展，LHON的基因治療成為可能，其中的難點在于轉染的基因進入細胞核，而LHON的突變位點在線粒體DNA，是線粒體中的ND4異常所致。

國內外已有公司或機構利用這一技術，利用腺相關病毒(adenovirus associatedvirus)pAAV2包裝該核酸序列(參見CN102634527B)為基因藥物，用于實驗研究和臨床試驗，已取得初步成效。但是利用pAAV2的轉導效率低，嚴重依賴HSP，而且表達緩慢，并會被可溶性肝素所抑制，而且只能到達視網膜淺層。因此急需一種轉導效率更高、表達迅速的ND4重組表達載體。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術中pAAV2包裝NADH脫氫酶亞單位4(ND4)序列為基因藥物時轉導效率低、表達緩慢等缺陷，提供一種ND4基因重組腺相關病毒載體及其制備方法和應用。本發明將pAAV9作為ND4的基因載體，將ND4轉導至病人眼中時，在確保安全性的同時，在視網膜上的表達量更高，具有更高的轉導效率和高效的表達能力，感染視神經細胞的能力更強。將其制備為玻璃體腔注射的藥物，能夠增強該基因在Leber’s基因治療中效果，并且可以減少注射劑量和縮短治愈時間。

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種包含ND4基因表達盒的重組腺相關病毒載體，所述重組腺相關病毒載體的骨架為pAAV9(即，9型重組腺相關病毒載體)，所述ND4基因表達盒包含人ND4基因或優化的人ND4基因。

較佳地，所述ND4基因表達盒從N端至C端依次包含啟動子、線粒體靶向序列、人ND4基因或優化的人ND4基因、和/或UTR序列。

較佳地，所述啟動子為CMV啟動子或CAG啟動子；所述啟動子的核苷酸序列優選如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示。

本發明中，所述線粒體靶向序列(MTS)可以為未經優化的MTS序列，可以為優化后的MTS序列。較佳地，所述線粒體靶向序列(MTS)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示；和/或，所述UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。