[發(fā)明專利]DNA納米球及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910542713.3
• 申請(qǐng)日: 2019-06-21
• 公開（公告）號(hào): CN112111560B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳瑩;楊晉;徐崇鈞;黃鑫;趙勝明;章文蔚;陳奧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6874;C12N15/11
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

本發(fā)明涉及基因測(cè)序領(lǐng)域，具體涉及一種DNA納米球及其制備方法和應(yīng)用。所述DNA納米球中結(jié)合有具有胡斯坦面結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。通過利用具有胡斯坦面結(jié)構(gòu)的物質(zhì)和至少兩個(gè)擴(kuò)增引物對(duì)環(huán)狀單鏈DNA進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，或者利用具有胡斯坦面結(jié)構(gòu)的物質(zhì)對(duì)環(huán)狀單鏈DNA進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，能夠獲得該DNA納米球。通過本發(fā)明所提供的方法制備DNA納米球，用于測(cè)序具有降低的重復(fù)序列比例和提高的測(cè)序質(zhì)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因測(cè)序領(lǐng)域，具體涉及一種DNA納米球及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

DNA?nanoball?sequencing(DNA?nanoball，DNB測(cè)序)，是一種高通量測(cè)序技術(shù)，可以用于測(cè)定生命體全基因組序列的排列與組成。該技術(shù)核心在于將基因組DNA片段環(huán)化成單鏈環(huán)狀DNA后，通過滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling?circle?amplification，RCA)技術(shù)，使環(huán)狀單鏈DNA形成由首尾相連的多個(gè)拷貝的單鏈DNA，并在溶液中自由折疊成納米球結(jié)構(gòu)，即DNA納米球(DNB)。DNA納米球由于自身所帶負(fù)電荷的相互排斥，可減少DNB個(gè)體之間的相互作用，使DNB個(gè)體間相互獨(dú)立?；贒NA?nanoball的矩陣列測(cè)序技術(shù)使得每個(gè)矩陣點(diǎn)的DNB具有至少幾百個(gè)拷貝數(shù)，這些拷貝聚集在一起產(chǎn)生強(qiáng)烈的信號(hào)，由此可以測(cè)序獲得DNB的測(cè)序結(jié)果。

然而，針對(duì)DNB測(cè)序技術(shù)的測(cè)序質(zhì)量還需要進(jìn)一步改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種DNA納米球及其制備方法和應(yīng)用。

評(píng)價(jià)不同測(cè)序技術(shù)的一個(gè)重要的指標(biāo)就是Duplicate值(Dup值)的大小。在二代測(cè)序中，Dup值特指測(cè)序所得到的重復(fù)序列的比例。評(píng)價(jià)是否為重復(fù)序列，需要滿足兩個(gè)條件：1)reads比對(duì)到基因組的位置與堿基是否完全一致，2)是比對(duì)到參考基因組的方向是否完全一致。同時(shí)滿足這兩點(diǎn)一致的時(shí)候，就被認(rèn)為是duplicate。在研究過程中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生dup的原因主要有：第一種是樣品dup，一些物種基因組結(jié)構(gòu)本身比較復(fù)雜，存在多處重復(fù)序列，使樣品在構(gòu)建文庫前本身就形成了dup；第二種是文庫dup，產(chǎn)生的原因是在構(gòu)建文庫過程中，一些相同片段的序列被擴(kuò)增；第三種是光學(xué)dup，產(chǎn)生的主要原因是同一個(gè)大的DNB的reads被誤識(shí)別成不同的DNB的時(shí)候，此時(shí)他們距離應(yīng)該很近本來是一組數(shù)據(jù)，但是卻產(chǎn)生了多組數(shù)據(jù)；第四種是由于DNB的形態(tài)結(jié)構(gòu)或大小導(dǎo)致，使鄰近的DNB區(qū)域被占據(jù)，從而產(chǎn)生了多組數(shù)據(jù)。其中第一種dup的產(chǎn)生是固定的，與樣品的物種來源有關(guān)。第二種dup可以通過控制文庫建庫方法。第三種和第四種dup，在不考慮成本的情況下，可以通過提高測(cè)序儀光學(xué)成像設(shè)備適當(dāng)?shù)馗纳坪驼{(diào)節(jié)DNB的大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)；但是在大規(guī)模測(cè)序或者說在高通量測(cè)序的過程中，測(cè)序成本的控制對(duì)于測(cè)序的生產(chǎn)應(yīng)用很重要，由此，如何在控制合適成本的前提下，例如基于當(dāng)前的光學(xué)系統(tǒng)，降低測(cè)序過程中產(chǎn)生的Dup值，提高測(cè)序的質(zhì)量至關(guān)重要。

本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)在DNA納米球高通量測(cè)序的研究過程中發(fā)現(xiàn)：為了能夠降低測(cè)序過程中所產(chǎn)生的Dup值，通常通過縮短RCA時(shí)間來達(dá)到相應(yīng)的目的。但是這種處理方式同時(shí)也會(huì)帶來很多缺點(diǎn)，例如第一，縮短RCA的時(shí)間，會(huì)影響DNB的測(cè)序質(zhì)量，尤其是矩陣密度高的測(cè)序芯片。擴(kuò)增時(shí)間短，盡管可以有效的降低dup值，但會(huì)導(dǎo)致DNB的拷貝數(shù)降低，使堿基的有效信號(hào)值降低。第二，縮短RCA的時(shí)間，所獲得的納米球無法滿足需要的測(cè)序讀長。讀長較長的測(cè)序需要較長片段的文庫，縮短滾環(huán)擴(kuò)增時(shí)間后，DNB拷貝數(shù)無法滿足測(cè)序需求。因此，如何既能保證納米球的拷貝數(shù)，又不會(huì)使得建庫測(cè)序過程中所產(chǎn)生的Dup值過高來滿足精準(zhǔn)測(cè)序的要求，至關(guān)重要。