[發(fā)明專利]一種真姬菇的原生質(zhì)體制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910538167.6
• 申請日: 2019-06-20
• 公開（公告）號: CN110172412A
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張積森;王剛;常小光;林婧嫻;郭琳;王園園
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/00;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學(xué)俊

本發(fā)明提供一種真姬菇的原生質(zhì)體制備方法，改變傳統(tǒng)裝有PDB培養(yǎng)基錐形瓶搖床培養(yǎng)產(chǎn)生球狀菌絲提取原生質(zhì)體方法，采樣帶玻璃渣的靜置培養(yǎng)、定期搖瓶的培養(yǎng)菌絲及無菌尼龍網(wǎng)過濾方法，選取不同的菌絲菌齡、溶壁酶酶液濃度、酶解時間、過濾離心速率及時間等，并根據(jù)原生質(zhì)體直徑大小采用G2漏斗過濾原生質(zhì)體等，吸取20ul滴于血球計數(shù)板上，在40倍的光學(xué)顯微鏡下鏡檢，計數(shù)，形成整套真姬菇原生質(zhì)體制備方法。采用本發(fā)明方法，真姬菇原生質(zhì)體數(shù)量達到1.0?2.2×10⁷個/mL，滿足真姬菇遺傳轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)的研究要求。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程中微生物育種的方法，特別涉及一種真姬菇的原生質(zhì)體制備方法。

背景技術(shù)

食用菌產(chǎn)業(yè)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位，“點草成金，變廢為寶”，實現(xiàn)循環(huán)經(jīng)濟，是可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)。真姬菇（Hypsizigus marmoreus），又稱為斑玉蕈、玉蕈、白玉、海鮮菇、鴻喜菇等，味比平菇鮮，質(zhì)比香菇韌，肉比滑菇厚，具有蟹香獨特的味道，其屬于真菌界（Fungi）、擔子菌門（Basidiomycotina）、傘 菌 綱（Agaricomycetes）、傘菌目（Agaricales）、離褶傘科（Lyop Hyllaceae）、玉蕈屬（Hypsizigus），是北溫帶一種珍稀名貴的食用真菌，適于北溫帶春秋季及冬季栽培，自然分布于歐洲、西伯利亞、日本及北美等地。

本文從菌絲出發(fā)對真姬菇原生質(zhì)體的制備的關(guān)鍵因素進行了探索性研究，為利用原生質(zhì)體高效遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)培育多功能新型菌株奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種真姬菇的原生質(zhì)體的制備方法 ，使其原生質(zhì)體的制備率達到1.0-2.2×10⁷個/mL。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的技術(shù)方案是:

（1）接健壯真姬菇菌絲到PDA菌體培養(yǎng)基平板上，24℃避光培養(yǎng)144h-240h。選擇生長健壯的菌絲平板，接菌絲于150ml帶有玻璃渣的PDB液體培養(yǎng)基中，玻璃渣大小為0.5-1cm×0.4 cm×0.2cm，避光靜置培養(yǎng)96h-120h，培養(yǎng)48h后，每8h手動搖動錐形瓶10min，割斷新長的菌絲。120h后轉(zhuǎn)接50ml含有健壯菌絲的液體培養(yǎng)基到120ml帶碎玻璃渣PDB液體培養(yǎng)基中，再次靜置培養(yǎng)48h-144h， 每8h于250rpm，24℃搖床培養(yǎng)1h。

（2）在超凈工作臺內(nèi)，用二層無菌尼龍紗布過濾出菌絲，用無菌水沖洗，接著用0.6mol/L甘露醇清洗2次，用滅菌的濾紙吸干。用0.6mol/L甘露醇溶液配制的含1-4wt.%溶壁酶的酶液，菌絲：酶液按1:10g/mL比例添加到裝有菌絲體的離心管內(nèi)，將離心管放入30℃水浴鍋中酶解1-4h，每30min，上下顛覆搖勻20次。

（3）在超凈工作臺內(nèi)，用G2漏斗過濾粗提液到離心管中并封口，在高速離心機3000-6000rpm 條件下離心10min，倒掉上清液，用移液槍吸取5ml穩(wěn)滲劑加入到離心管中，將沉淀混勻，重復(fù)3000-6000rpm 條件下離心10min，倒掉上清，加1ml穩(wěn)滲劑，將沉淀混勻。吸取20ul滴于血球計數(shù)板上，在40倍的光學(xué)顯微鏡下鏡檢，計數(shù)。原生質(zhì)體數(shù)量達到1.0-2.2× 10⁷個/mL。

所述的真姬菇的原生質(zhì)體制備方法，最佳工藝參數(shù)是: