[發(fā)明專利]一種真姬菇的原生質(zhì)體制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910538167.6
• 申請日: 2019-06-20
• 公開（公告）號: CN110172412A
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張積森;王剛;常小光;林婧嫻;郭琳;王園園
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/00;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學(xué)俊

1.一種真姬菇的原生質(zhì)體制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）接健壯真姬菇菌絲到PDA菌體培養(yǎng)基平板上，24℃避光培養(yǎng)144h-240h；選擇生長健壯的菌絲平板，接菌絲于帶有玻璃渣的150mlPDB液體培養(yǎng)基中，玻璃渣大小為0.5-1cm×0.4 cm×0.2cm，避光靜置培養(yǎng)96h-120h，培養(yǎng)48h后，每8h手動搖動錐形瓶10min，割斷新長的菌絲；120h后轉(zhuǎn)接50ml含有健壯菌絲的液體培養(yǎng)基到另外120ml帶碎玻璃渣PDB液體培養(yǎng)基中，再次靜置培養(yǎng)48h-144h， 每8h于250rpm，24℃搖床培養(yǎng)1h；

（2）在超凈工作臺內(nèi)，用二層無菌尼龍紗布過濾出菌絲，用無菌水沖洗，接著用0.6mol/L甘露醇溶液清洗2次，用滅菌的濾紙吸干；用0.6mol/L甘露醇溶液配制的含1-4wt.%溶壁酶的酶液，菌絲：酶液按1:10g/mL比例添加到裝有菌絲體的離心管內(nèi)，將離心管放入30℃水浴鍋中酶解1-4h，每30min，上下顛覆搖勻20次；

（3）在超凈工作臺內(nèi)，用G2漏斗過濾粗提液到離心管中并封口，在高速離心機3000-6000rpm 條件下離心10min，倒掉上清液，用移液槍吸取5ml穩(wěn)滲劑加入到離心管中，將沉淀混勻，重復(fù)3000-6000rpm 條件下離心10min，倒掉上清，加1ml穩(wěn)滲劑，將沉淀混勻；吸取20ul滴于血球計數(shù)板上，在40倍的光學(xué)顯微鏡下鏡檢，計數(shù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）接健壯真姬菇菌絲到PDA菌體培養(yǎng)基平板上，24℃避光培養(yǎng)200h；選擇生長健壯的菌絲平板，接菌絲于帶有玻璃渣的150mlPDB液體培養(yǎng)基中，玻璃渣大小為0.5-1cm×0.4 cm×0.2cm，避光靜置培養(yǎng)110h，培養(yǎng)48h后，每8h手動搖動錐形瓶10min，割斷新長的菌絲；120h后轉(zhuǎn)接50ml含有健壯菌絲的液體培養(yǎng)基到另外120ml帶碎玻璃渣PDB液體培養(yǎng)基中，再次靜置培養(yǎng)96h，每8h于250rpm，24℃搖床培養(yǎng)1h；

（2）在超凈工作臺內(nèi)，用二層無菌尼龍紗布過濾出菌絲，用無菌水沖洗，接著用0.6mol/L甘露醇清洗2次，用滅菌的濾紙吸干，用0.6mol/L甘露醇溶液配制的含2wt.%溶壁酶的酶液，菌絲：酶液按1:10g/mL比例添加到裝有菌絲體的離心管內(nèi)，將離心管放入30℃水浴鍋中酶解3h，每30min，上下顛覆搖勻20次； （3）在超凈工作臺內(nèi)，用G2漏斗過濾粗提液到離心管中并封口，在高速離心機4000rpm 條件下離心10min，倒掉上清液，用移液槍吸取5ml穩(wěn)滲劑加入到離心管中，將沉淀混勻，重復(fù)4000rpm 條件下離心10min，倒掉上清，加1ml穩(wěn)滲劑，將沉淀混勻；吸取20ul滴于血球計數(shù)上，在40倍的光學(xué)顯微鏡下鏡檢，計數(shù)。