[發明專利]用于檢測分泌型PD-L1拼接變體的RT-PCR引物、試劑盒及鑒定方法

在審

• 申請號: 201910536704.3
• 申請日: 2019-06-20
• 公開（公告）號: CN112111574A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 周軍
• 申請（專利權）人: 鋒宏生物醫藥科技（昆山）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 昆山中際國創知識產權代理有限公司 32311
• 代理人: 盛建德;陳寧

1.一種用于檢測分泌型PD-L1拼接變體的RT-PCR引物，其特征在于，由下列引物對組成：

針對肺癌腫瘤的引物對I：

正向引物：CCAAATGAAAGGACTCACTTG；

反向引物：CGTCTCCTCCAAATGTGTATCTT；

針對多發性骨髓瘤的引物對II：

正向引物：AAGTCCTGAGTGGAGATTAGATC；

反向引物：CATTCTCCCAAGTGAGTCC；和

針對淋巴瘤的引物對III：

正向引物：ACCAGCACACTGAGAATCAAC；

反向引物：CACATCCATCATTCTCCCAAG。

2.一種含權利要求1所述引物對的用于檢測分泌型PD-L1拼接變體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括引物對和cDNA模板，其中所述引物對由所述引物對I、引物對II和引物對III組成，其中cDNA模板是由總RNA模板通過反轉錄酶反轉錄而成，且所述總RNA模板是通過總RNA提取試劑盒從腫瘤細胞AMO-1、JJN-3、MM.1S、H69、H526、SU-DHL-4和SU-DHL-6中提取所得。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括雙蒸水、PCR反應緩沖液、dNTPs和熱啟動高效Taq酶。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括2μM引物對I的正向引物1μL、2μM引物對I的反向引物1μL、2μM引物對II的正向引物1μL、2μM引物對II的反向引物1μL、2μM引物對III的正向引物1μL、2μM引物對III的反向引物1μL、經稀釋20倍的cDNA模板1μL、雙蒸水4.8μL、10×PCR反應緩沖液1μL、2mM each的dNTPs 1μL、2.5U/μL的熱啟動高效Taq酶0.1μL。

5.一種基于權利要求2至4中任一權利要求所述試劑盒的用于檢測分泌型PD-L1拼接變體的RT-PCR鑒定方法，其特征在于，包括下述步驟：

S1：從患者腫瘤細胞樣品中提取總RNA，采用反轉錄酶將該總RNA逆轉錄為cDNA，以該cDNA為模板利用所述引物對I、引物對II和引物對III進行PCR擴增實驗，反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗，得到待測樣品結果圖；

S2：根據待測樣品結果圖上顯示的擴增出的DNA片段大小進行待測樣品結果判定。

6.根據權利要求5所述的鑒定方法，其特征在于，所述PCR擴增實驗中PCR反應程序為：依次進行95℃下預變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，進行45次循環，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后結束。

7.根據權利要求5所述的鑒定方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠電泳實驗結束后，分析樣品結果圖時，判定依據為所述引物對I、引物對II和引物對III分別擴增出的DNA片段大小；其中

針對肺癌腫瘤的PD-L1拼接變體PD-L1-1對應的引物對I擴增出的DNA片段大小為103bp；

針對多發性骨髓瘤的PD-L1拼接變體PD-L1-3對應的引物對II擴增出的DNA片段大小為104bp；

針對淋巴瘤的PD-L1拼接變體PD-L1-9對應的引物對III擴增出的DNA片段大小為161bp。