[發明專利]利用Crispr/Cas9技術制備MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的細胞克隆

在審

• 申請號: 201910531285.4
• 申請日: 2019-06-19
• 公開（公告）號: CN110257434A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 李樹峰;佟慧麗;嚴云勤
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;C12N15/12
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利用Crispr/Cas9技術制備MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的細胞克隆，屬于基因工程技術領域，其特征在于：細胞克隆被分離純化且經過2％馬血清誘導分化后可以形成肌纖維；該骨骼肌衛星細胞具有融合為肌管的能力；MSTN基因敲除載體靶位點已成功連接，未發生堿基突變；實驗組細胞經分化能夠形成一定數目的肌管，表明干擾MyoG基因后，細胞依然能夠分化成為肌管，但總體肌管融合率降低，形態和數目較對照組有極顯著差異。

技術領域

本發明涉及利用Crispr/Cas9技術制備MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的細胞克隆，屬于基因工程技術領域。

背景技術

轉基因技術已成為現代動物育種技術的重要手段，被公認是遺傳學研究中繼20世紀初的連鎖分析、60年代的體細胞遺傳和70年代基因克隆技術之后的第四代技術，被列為生物學發展史上的轉折點。傳統的動物品種改良只能在同種或親緣關系很近的物種之間進行，且以自然突變作為選種的前提，這種自然突變的發生幾率相當低。轉基因技術則可以克服上述問題，創造新突變或打破物種間基因交流限制，加快動物改良進程。目前轉基因技術已經成功地應用在提高動物個體的生長速度、改良家畜的生產品質和增強抗逆、抵御疾病的能力等方面。例如，1998年美國農業部研究人員成功獲得了促生長轉基因豬(胰島素樣生長因子)。顯著改變了豬的產肉性能，豬肉脂肪含量減少10％，瘦肉含量增加6％～8％，顯著提高了豬的經濟性能。Wall等利用轉基因的方法得到了牛乳腺特異表達溶葡球菌酶(Lysostaphin)的轉基因牛，轉基因牛乳房進行金黃色葡萄球菌培養物注射實驗發現，與非轉基因牛相比較，轉基因牛乳房抗菌能力提高5倍，為畜牧業中疾病的防治提供一個新的可行的路線。2003年， Brophy等培育的轉基因牛牛奶中β-酪蛋白的含量提高了20％，κ-酪蛋白的含量也增加了2倍，很大程度上提高了牛乳乳蛋白含量，增加了牛乳的營養價值。目前，我國科學家已經利用轉基因技術在動物育種中獲得了一些成就，如2010年，內蒙古大學李光鵬教授課題組獲得了轉線蟲Fat-1轉基因牛，多不飽和脂肪酸比值得到明顯提高。食用這種牛肉對于改善人體不飽和脂肪酸組成，預防心腦血管疾病等具有重要作用。2011年，中國農業大學李寧課題組利用鋅指酶技術首次獲得了MSTN雙等位基因敲除牛，該牛臀部肌肉明顯比對照普通牛增加。但是在目前的轉基因動物育種的研究中通常都是針對單一的基因進行操作，效果有限，且常用的轉基因方法操作繁瑣，難度大，成功率低，研究成本高。2013年，CRISPR/Cas9技術被應用于轉基因操作(Cong L，2013；Mali，2013；Hwang，2013；Chang N，2013；Shen B，2013)，它基于細菌的獲得性免疫系統改造而成(Westra，2010；Garneau，2010)，其操作簡單、成本低、作用高效，適用于大多分子生物學實驗室，尤其是不需要抗性基因作為篩選標記，這對動物育種具有重要的意義。它作為新興的基因組定點編輯技術逐漸成熟并已在多個物種中得到應用，其中包括：大腸桿菌、肺炎雙球菌、釀酒酵母、小鼠、果蠅、線蟲、大鼠、小麥、水稻、擬南芥中，這為基因功能領域的研究提供廣闊前景(Hwang，2013；Gilbert，2013)。肌細胞生成素(Myogenin，MyoG)是生肌調節因子家族成員之一，是肌細胞終末端分化的關鍵因子，其可以促進成肌細胞的增殖，使單核成肌細胞轉變成為多核的肌纖維，在肌細胞的生成過程中起著中心調控作用，這一功能其它生肌調節因子無法代替(胡迎春等，2004；Charge SB等，2004；Schuster-Gossler K等，2007；Vasyutina E等，2007)。Nabeshima等(1993) 通過胚胎干細胞基因打靶使小鼠MyoG基因失活，產生突變純合小鼠，MyoG基因缺失的小鼠雖有成肌細胞正常存在，但絕大部分細胞不分化形成肌纖維，由于骨骼肌的缺損，這些純合突變小鼠在出生前后致死。MyoG基因在肌肉形成后也可以發揮著重要作用，Jennifer等 (2005)通過Cre-loxP技術在小鼠胚胎肌肉形成之后敲除MyoG發現，MRFs家族其他成員如MyoD和Myf5都有不同程度的下降，小鼠骨骼肌能夠正常形成也能夠出生并存活，但是出生后的體重比野生型小30％，相同位置的骨骼肌的尺寸與重量均小于野生型。這說明MyoG 不僅控制胚胎期的肌肉形成，而且對于出生后的肌肉生長也是極為重要的。在牛和豬中，科學家進行了大量的MyoG基因多態性分析。研究表明MyoG基因的突變位點與豬、牛的初生重有關，MyoG不同的基因型可影響肌纖維的數目，同時影響肉的質量。王珊等(2006)克隆了牛MyoG基因的啟動子序列后，采用PCR-RFLP技術研究了該基因啟動子序列多態性與牛生長發育性狀之間的相關性。結果表明：牛MyoG基因啟動子表現出多態性，含有AA、 AB基因型。其中AA基因型個體在體高、體重等生長性狀指標上顯著高于AB型個體，AA 基因型為優勢基因型。林萬華等(2000)也利用PCR-RFLP的方法證實了MyoG基因對豬的胴體性狀有顯著影響。MyoG由于其基因的多態性能夠影響產肉動物的肉質，也使其成為產肉動物生產育種的候選基因。以上這些研究都表明MyoG基因是與肌纖維數目有關的基因，其不同的基因型可影響肌纖維的數目，同時影響了肉的質量。大量的研究表明，脊椎動物的肌肉組織在出生以后肌纖維的數目是不再改變，肌肉的生長主要依賴于肌纖維纖維長度增加和周徑增大(Buonanno A等，1996；張海平等，2008；孫文杰等2009)。因此，通過對MyoG 基因人為的修飾或改造，增加其表達時間和表達量可能有助于增加肌纖維的數量，從而提高產肉量。肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)是抑制肌肉分化和生長的基因，MSTN通過阻止細胞周期進程實現抑制成肌細胞增殖的功能。大量研究表明，在體外培養的成肌細胞中，MSTN具有阻止細胞周期由G1期向S期的轉變的功能，進而抑制成肌細胞的增殖(Thomas，2000；Taylor，2001；Joulia，2003)。McPherron等人通過基因敲除技術使小鼠體內MSTN基因不能發揮作用，結果發現突變小鼠的體型明顯大于野生型老鼠，每塊骨骼肌質量都是野生型3到4倍，而且MSTN基因失活小鼠骨骼肌纖維的數量比正常野生小鼠高出86％，由這些現象可以推測這些肌肉質量的增加可能是由于MSTN基因失活導致肌細胞增生和肥大造成的。Lin等(2002)成功研制轉基因的小鼠，這些小鼠所表達的MSTN發生突變，肌肉重量增加20-35％，研究中還發現肌肉的增加不是由于肌纖維增生而引起的，而是由肌纖維肥大導致的。因此如何根據MyoG基因和MSTN基因在肌肉分化和發育中的重要作用，將目前最先進的基因打靶技術CRISPR/Cas9技術應用于轉基因牛的研究中，對MyoG和MSTN兩個基因進行操作，同時實現促肌肉分化的MyoG基因的高表達并敲除抑制肌纖維增殖的MSTN基因，研究其對牛骨骼肌衛星細胞分化和增殖及下游基因表達的影響成為目前養牛生產過程中急需解決的一大難題，所以利用CRISPR/Cas9技術同時對MSTN和MyoG兩個基因進行修飾改造，并對改造的牛骨骼肌衛星細胞分化和增殖情況進行檢測，并研究其作用的分子機制。肌纖維的數量將得到增加，肌纖維將發育得更為粗大，從而提高產肉率，進一步通過體細胞核移植技術就可能獲得適合本地環境的高產肉牛，研究其對牛骨骼肌衛星細胞分化和增殖及下游基因表達的影響，發明利用Crispr/Cas9技術制備MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的細胞克隆是必要的。