[發明專利]利用Crispr/Cas9技術制備MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的細胞克隆

在審

• 申請號: 201910531285.4
• 申請日: 2019-06-19
• 公開（公告）號: CN110257434A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 李樹峰;佟慧麗;嚴云勤
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;C12N15/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.利用Crispr/Cas9技術制備MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的細胞克隆，其特征在于：所述的細胞克隆被分離純化且經過2％馬血清誘導分化后可以形成肌纖維；利用免疫熒光技術對牛骨骼肌衛星細胞進行鑒定，結果顯示，CD34、Sca-1、Desmin在牛骨胳肌衛星細胞中均呈陽性，隨機計數100個細胞，3種抗體的陽性細胞高達98％以上；α-actin、MHC及MyoG在誘導分化后的肌管中呈陽性表達，表明該骨骼肌衛星細胞具有融合為肌管的能力；MSTN基因敲除載體：BbsI單酶切psPgRNA、pX330，酶切電泳的鑒定結果均與預期大小相符；分別按照預定的設計，合成針對第二外顯子和第三外顯子的兩個靶點的sgRNA的引物，退火后與單酶切的psPgRNA、pX330質粒連接，共獲得4個MSTN的敲除載體psPgRNA-M-A、pX330-M-A、psPgRNA-M-B和pX330-M-B，可確認靶位點已成功連接，未發生堿基突變；利用RNA干擾技術研究MyoG基因對牛骨骼肌衛星細胞分化的影響：在相差顯微鏡下觀察細胞分化72h后所形成的肌管形態，實驗對細胞分化72h后所形成的肌管數目及肌管融合率進行了統計分析，結果表明，實驗組細胞經分化能夠形成一定數目的肌管，與陰性對照組細胞相比，長肌管所占的比例及短小的肌管所占的比例均有顯著差異，表明干擾MyoG基因后，細胞依然能夠分化成為肌管，但總體肌管融合率降低，形態和數目較對照組有極顯著差異；利用實時熒光定量PCR檢測肌肉分化標志性基因MCK的表達變化：結果顯示，無論是MyoG基因干擾組還是對照組，進入分化期間的細胞，MCK基因mRNA的表達量顯著增加，且隨著分化時間的增長，基因表達量呈極顯著的上升趨勢；但MyoG基因干擾組與對照組相比，MCK基因的表達顯著降低。