[發(fā)明專利]硫氧還蛋白還原酶重組蛋白及其編碼基因

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• 申請日: 2019-06-18
• 公開（公告）號: CN112094825A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發(fā)明（設計）人: 尹漢維
• 申請（專利權）人: 凱熙醫(yī)藥（武漢）股份有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C07K19/00;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/85;C12Q1/26
• 代理公司: 北京知元同創(chuàng)知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 劉元霞

本發(fā)明涉及一種硫氧還蛋白還原酶重組蛋白，是通過密碼子優(yōu)化的方式得到硫氧還蛋白還原酶編碼基因，如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示，并將其在大腸桿菌和哺乳細胞中進行表達，得到重組蛋白。本發(fā)明的硫氧還蛋白還原酶重組蛋白序列完整，經驗證其可與現(xiàn)有的TrxR1抗體特異性結合，方法簡單，應用廣泛。

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一種硫氧還蛋白還原酶重組蛋白及其編碼基因。

背景技術

硫氧還蛋白系統(tǒng)包括硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase，TrxR)、硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，NADPH)，是一個廣泛分布的NADPH依賴性二硫化物還原酶系統(tǒng)。

硫氧還蛋白還原酶是一種NADPH依賴的包含F(xiàn)AD結構域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，包含保守的Cys Val Asn Val GlyCys氧化還原位點，催化依賴硫氧還蛋白NADPH還原反應。硫氧還蛋白還原酶活性檢測可評價人體異常增生活性水平，硫氧還蛋白還原酶可實時檢測人體內的異常增生活躍程度，由于不可逆惡性增生是腫瘤的重要特征，在癌癥的早期階段該值就會明顯升高，因此硫氧還蛋白還原酶是一種特異性、敏感性、廣譜性都較高的腫瘤標志物。

因此，體外制備硫氧還蛋白還原酶對于相關疾病的診斷和治療研究具有非常重要的意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種硫氧還蛋白還原酶重組蛋白(TXNRD1)及其編碼基因。

本發(fā)明采用如下技術方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種硫氧還蛋白還原酶重組蛋白，在氨基酸序列C端添加6個His(HHHHHH)片段，氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

第二方面，本發(fā)明提供一種硫氧還蛋白還原酶重組蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。在本發(fā)明的一個實施方案中，是對硫氧還蛋白還原酶氨基酸序列密碼子優(yōu)化后，通過基因合成的方式得到編碼基因。

第三方面，本發(fā)明還提供重組載體，含有所述硫氧還蛋白還原酶重組蛋白的編碼基因。在本發(fā)明一個實施方案中，將所述編碼基因亞克隆到表達載體，構成重組載體；例如，所述載體為pET28b；在本發(fā)明另一個實施方案中，將所述編碼基因亞克隆到克隆載體，構成重組載體；例如，所述載體為pUC19。

第四方面，本發(fā)明提供所述硫氧還蛋白還原酶重組蛋白的編碼基因的表達方法，包括如下步驟：

(1)將硫氧還蛋白還原酶氨基酸序列密碼子優(yōu)化得到編碼基因，利用基因合成的方式得到編碼基因，例如，通過線上軟件進行氨基酸序列密碼子優(yōu)化；

(2)構建重組載體；

將PCR擴增的DNA序列和質粒載體用限制性內切酶進行雙酶切，用DNA連接酶連接純化的酶切產物，得到重組載體；所述載體可以為克隆載體或者表達載體；

(3)將重組載體轉化到感受態(tài)細胞，培養(yǎng)篩選，測序驗證；

(4)構建表達菌株或表達細胞，表達蛋白；

(5)重組蛋白純化，利用Ni樹脂純化方式純化。

根據本發(fā)明的表達方法，所述硫氧還蛋白還原酶重組蛋白編碼基因由大腸桿菌表達或者由哺乳細胞表達，例如有大腸桿菌或者HEK293細胞表達。