[發(fā)明專利]硫氧還蛋白還原酶重組蛋白及其編碼基因

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910528023.2
• 申請(qǐng)日: 2019-06-18
• 公開（公告）號(hào): CN112094825A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹漢維
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 凱熙醫(yī)藥（武漢）股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C07K19/00;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/85;C12Q1/26
• 代理公司: 北京知元同創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11535
• 代理人: 劉元霞

1.一種硫氧還蛋白還原酶重組蛋白，其特征在于，所述硫氧還蛋白還原酶重組蛋白在氨基酸序列C端添加6個(gè)His(HHHHHH)片段。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫氧還蛋白還原酶重組蛋白，其特征在于，所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

3.一種硫氧還蛋白還原酶重組蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQID NO.4所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的硫氧還蛋白還原酶重組蛋白的編碼基因，是對(duì)硫氧還蛋白還原酶的氨基酸序列密碼子優(yōu)化后，通過基因合成的方式得到編碼基因。

5.重組載體，含有權(quán)利要求3或4所述硫氧還蛋白還原酶重組蛋白的編碼基因；

優(yōu)選地，是將所述編碼基因亞克隆到載體得到；

優(yōu)選地，所述載體選自表達(dá)載體或者克隆載體；例如，所述表達(dá)載體為pET28b；例如，所述克隆載體為pUC19。

6.一種硫氧還蛋白還原酶重組蛋白編碼基因的表達(dá)方法，包括如下步驟：

(1)將硫氧還蛋白還原酶氨基酸序列密碼子優(yōu)化得到編碼基因，利用基因合成的方式得到編碼基因的DNA片段；

(2)構(gòu)建重組載體；

PCR擴(kuò)增步驟(1)得到的DNA片段，和載體用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，用DNA連接酶連接純化的酶切產(chǎn)物，得到重組載體；優(yōu)選地，所述載體選自克隆載體或表達(dá)載體；

(3)將重組載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)篩選，測(cè)序驗(yàn)證；

(4)構(gòu)建表達(dá)菌株或表達(dá)細(xì)胞，表達(dá)蛋白；

優(yōu)選地，所述表達(dá)方法還可以包括步驟(5)重組蛋白純化，更優(yōu)選利用Ni樹脂純化方式純化。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的硫氧還蛋白還原酶重組蛋白編碼基因的表達(dá)方法，其特征在于，所述編碼基因如權(quán)利要求3或4所述；

優(yōu)選地，所述硫氧還蛋白還原酶重組蛋白編碼基因由大腸桿菌表達(dá)或者由哺乳細(xì)胞表達(dá)。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的硫氧還蛋白還原酶重組蛋白編碼基因的表達(dá)方法，所述步驟(2)的載體為表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體，

所述步驟(3)為將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)菌落PCR篩選并測(cè)序確定為目標(biāo)表達(dá)菌株；

所述步驟(4)為將目標(biāo)表達(dá)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，體外誘導(dǎo)表達(dá)，得到所述硫氧還蛋白還原酶重組蛋白。

9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的硫氧還蛋白還原酶重組蛋白編碼基因的表達(dá)方法，所述步驟(2)的載體為克隆載體，得到重組克隆載體，

所述步驟(3)為將重組克隆載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)菌落PCR篩選并測(cè)序確定為目標(biāo)菌株；

所述步驟(4)是從目標(biāo)菌株中提取質(zhì)粒，瞬間轉(zhuǎn)染到表達(dá)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，表達(dá)蛋白。

10.如權(quán)利要求1或2所述的硫氧還蛋白還原酶重組蛋白在硫氧還蛋白還原酶活性檢測(cè)中的應(yīng)用；優(yōu)選所述硫氧還蛋白還原酶重組蛋白作為參比蛋白或者標(biāo)準(zhǔn)品輔助用于通過酶動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)離體生物樣本中硫氧還蛋白還原酶活性水平。