[發明專利]一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201910525650.0
• 申請日: 2019-06-18
• 公開（公告）號: CN110229918A
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發明（設計）人: 呂觀;張璜;鄭聖騰;陳洵;石磊;常彥磊
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/6806;C12Q1/04;C12R1/445
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 王會龍

一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法及其試劑盒。該方法包括利用免疫磁珠富集金黃色葡萄球菌，對富集的金黃色葡萄球菌進行DNA提取，對提取的金黃色葡萄球菌的DNA進行LAMP檢測等步驟。本發明的方案，使用鏈霉親和素?生物素介導偶聯的免疫磁珠，制備時間為1h，大大降低了制備免疫磁珠的時間。同時鏈霉親和素與生物素間有極高的親和力，故本發明的免疫磁珠能夠與抗體和磁珠直接偶聯制備的免疫磁珠相比，本發明的磁珠表面能夠結合更多抗體，從而大大提高了捕獲率。

技術領域

本發明屬于食品微生物檢測技術領域，涉及一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法及其試劑盒。

背景技術

金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性致病菌，常存在于奶、肉、蛋、魚、蝦等食品中，其產生的腸毒素可引起食物中毒，導致皮膚和軟組織感染、敗血癥、骨髓炎和肺炎等疾病。目前我國用于檢測食品中食源性致病菌的傳統方法多為選擇性培養基、顯微鏡鏡檢和生化培養鑒定等，其優點是操作簡便，所需設備簡單，但耗時長、靈敏性差，無法快速檢測，會對經濟生產活動產生一定的影響。

隨著免疫學和分子生物學在食品安全方面的應用，致病菌的檢測效率正在逐步提升，目前常采用的方法有聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)、基因芯片法、酶聯免疫吸附測定技術(enzymelinkedimmunosorbent assay,ELASA)、生物傳感器等，但這些方法仍需要昂貴的試劑與實驗設備，無法滿足突發公共衛生事件時對食源性致病菌快速、準確、便攜的現場檢測需求。

免疫磁珠分離技術(immunomagnetic separation，IMS)就是目前運用廣泛的一種快速有效的前處理方法,能夠縮短微生物檢測的增菌時間,實現微生物致病菌的快速檢測。1979年,Ugelstad等人首次制成了分離細胞效果極佳的免疫磁珠，因其操作簡便、特異性強、可有效保持目標物原有的特性,被廣泛應用于分子生物學領域。該技術利用具有磁性的微顆粒結合特定抗體，在液相中能特異性地與相應的抗原結合，依靠磁場的作用力快速地與樣品稀釋液分離，從而達到富集、純化樣品的目的。

2000年，Notomi等人提出了一種新型核酸擴增技術，環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，該技術利用4～6條的特異性引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在等溫條件(60～65℃)下可高效、快速、特異性地擴增靶序列。該技術避免了核酸擴增對溫度和昂貴儀器的要求，并且該技術特異性強、靈敏度高、實驗步驟簡單、不需要專業的技術人員，適合現場快速檢測食源性致病菌。本發明建立了一種免疫磁珠-環介導等溫擴增法(IMS-LAMP)對金黃色葡萄球菌進行快速、準確的檢測，該方法避免使用價格高昂的儀器，降低了實驗成本。

發明內容

有鑒于此，本發明所解決的技術問題在于提供一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法及。

本發明所解決的技術問題還在于提供一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一方面，本發明公開了一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法，包括如下步驟：

1)利用免疫磁珠富集金黃色葡萄球菌:取1mL待測樣品于1.5mL離心管中,投入免疫磁珠300μL混勻；垂直混勻儀上室溫孵育30min后，將其置于磁力架上3min使磁珠充分吸附后，將上清液棄去，取下磁力架上的離心管，加入1mL的0.01mol/LPBS洗滌懸浮，充分混勻，然后置于磁力架上3min，使磁珠充分吸附后，棄去懸浮液，重復洗滌3次，加入1mL0.01mol/LPBS震蕩重懸磁珠，將富集得到的磁珠-菌體復合物用于后續的DNA提取及環介導等溫擴增法(LAMP)的檢測；