[發明專利]一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201910525650.0
• 申請日: 2019-06-18
• 公開（公告）號: CN110229918A
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發明（設計）人: 呂觀;張璜;鄭聖騰;陳洵;石磊;常彥磊
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/6806;C12Q1/04;C12R1/445
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 王會龍

1.一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于包括如下步驟：

1)利用免疫磁珠富集金黃色葡萄球菌:取1mL待測樣品于1.5mL離心管中,投入免疫磁珠300μL混勻；垂直混勻儀上室溫孵育30min后，將其置于磁力架上3min使磁珠充分吸附后，將上清液棄去，取下磁力架上的離心管，加入1mL的0.01mol/L PBS洗滌懸浮，充分混勻，然后置于磁力架上3min，使磁珠充分吸附后，棄去懸浮液，重復洗滌3次，加入1mL 0.01mol/LPBS震蕩重懸磁珠，將富集得到的磁珠-菌體復合物用于后續的DNA提取及環介導等溫擴增法(LAMP)的檢測；

2)對富集的金黃色葡萄球菌進行DNA提取:采用市售的DNA提取試劑盒提取磁珠-菌體復合物的DNA，其原理是基于硅膠柱純化方式，利用試劑盒中的溶菌酶(Lysozyme)消化去除金黃色葡萄球菌的細胞壁，在裂解液和蛋白酶(Proteinase K)作用下裂解消化，DNA釋放到裂解液中；加入乙醇后，轉移至吸附柱(Column)中過濾，DNA被吸附至吸附柱的膜上，而蛋白質則被去除；吸附柱經洗滌后去除其他雜質，最后通過低鹽緩沖液洗脫DNA，洗脫的DNA可直接用于后續的LAMP的檢測；

3)對提取的金黃色葡萄球菌的DNA進行LAMP檢測:使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，將63℃15s，63℃45s作為一個循環，于63℃45s處收集熒光信號，30個循環；反應完成后，根據機器繪制的擴增曲線判斷擴增結果，若出現“S”形曲線則為陽性擴增，而獲得線性或稍微傾斜的擴增曲線則為陰性擴增。

2.如權利要求1中所述快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，步驟1)中所用免疫磁珠的制備方法為：

顛倒混勻PBS溶液中的500nm鏈霉親和素磁珠，吸取50μl的鏈霉親和素磁珠加入1.5ml滅菌離心管中；然后加1ml 0.01mol/LPBST緩沖液，洗滌磁珠，磁場吸附，棄上清液；

將磁珠重懸于1ml 0.01mol/LPBST緩沖液，加入20μl含生物素標記的金黃色葡萄球菌的多克隆抗體，垂直混勻儀上輕柔振蕩，在室溫下孵育45分鐘；

在磁場吸附，棄去上清液；后加入0.01mol/LPBST緩沖液(每次1ml)洗滌磁珠3次，每次5min，磁場吸附，棄去上清液；

最后將磁珠重懸在含有0.02％Na3N，0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBST緩沖液中，用于后續實驗，免疫磁珠保存于4℃冰箱，盡量在一周之內使用。

3.如權利要求1中所述快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于：步驟3)中的LAMP反應體系設置為25μL，按照N+2個數量計算各組分用量，其中N個待檢樣品+1個陰性對照+1個陽性對照，將反應液置于1.5mL離心管中，漩渦混勻，離心30秒，分裝于0.2mLPCR管中，并向每管加入約20μL礦物油，然后加入2μL提取的金黃色葡萄球菌基因組，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行擴增反應。

4.如權利要求3中所述快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，LAMP反應體系成分為：2×RM反應液12.5μL，ddH2O8μL，引物1μL，SYTO-9工作液0.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，待檢測DNA2μL。

5.如權利要求3中所述快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述引物序列如下：

F3引物：GGATGGCTATCAGTAATGTT；

B3引物：GCTAAGCCACGTCCATAT；

FIP引物：ACTGTTGGATCTTCAGAACCACCGCTACTAGTTGCTTAGTGTTA；

BIP引物：AGCGATTGATGGTGATACGGTTCAGGACCATATTTCTCTACACC；

LoopF引物：TGCTGAGCTACTTAGACTTGAA；

LoopB引物：AGGTCAACCAATGACATTCAGA。

6.一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：免疫磁珠，DNA提取試劑，LAMP反應液，陽性對照和陰性對照。