[發(fā)明專利]一種神經(jīng)元凍存液及神經(jīng)元凍存、復(fù)蘇方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910516679.2
• 申請日: 2019-06-14
• 公開（公告）號: CN110338188B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭安臣;王群;王擁軍
• 申請（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/0793
• 代理公司: 北京東方靈盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11506
• 代理人: 蘇向銀;馬敬

本發(fā)明公開了一種神經(jīng)元凍存液，包括以下體積份數(shù)的組分：45.00～55.00份神經(jīng)元培養(yǎng)基、40.50～49.50份10％牛血清白蛋白以及4.50～5.50份二甲基亞砜；神經(jīng)元凍存液不含有谷氨酰胺。上述神經(jīng)元凍存液，牛血清白蛋白能夠保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，能減輕不利環(huán)境對神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，既能利用二甲基亞砜的作用使溶液冰點(diǎn)降低，在緩慢凍結(jié)條件下，細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷，又能避免二甲基亞砜濃度過高，對凍存細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。此外，上述神經(jīng)元凍存液中不含有一般培養(yǎng)基中普遍添加的谷氨酰胺，相比于含有谷氨酰胺的而言，能夠較少細(xì)胞毒性，復(fù)蘇后神經(jīng)元活力較高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)元凍存液及神經(jīng)元凍存、復(fù)蘇方法。

背景技術(shù)

在圍繞神經(jīng)系統(tǒng)的研究中，神經(jīng)元的原代分離培養(yǎng)是非常重要的體外研究，用于研究神經(jīng)細(xì)胞的各種生理功能，由于神經(jīng)組織獲得的局限性，關(guān)于神經(jīng)元原代分離主要是在嚙齒類哺乳動物上進(jìn)行。例如，常用于神經(jīng)元原代分離的嚙齒類動物有胎鼠、新生鼠。然而由于神經(jīng)元細(xì)胞缺乏增殖能力，一次原代分離后，在體外不適宜長期存活、生長、分化，不利于研究的順利進(jìn)行；此外，對于原代神經(jīng)元來說，其對外界環(huán)境尤為敏感，不良刺激后極易死亡，所以神經(jīng)組織的原代細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中，一般都是現(xiàn)用現(xiàn)分離新鮮組織培養(yǎng)，這就導(dǎo)致了在研究原代神經(jīng)元時(shí)，由于研究目標(biāo)取材的限制，例如胎鼠、新生鼠獲取的不易、周期較長，綜合導(dǎo)致研究周期成本的增高。

細(xì)胞冷凍技術(shù)作為一種保存細(xì)胞的有效方法在生物學(xué)領(lǐng)域已深入廣泛的應(yīng)用。研究人員經(jīng)常需要冷凍細(xì)胞并保存，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)或臨床使用。傳統(tǒng)的低溫冷凍保存技術(shù)是將二甲亞砜和血清中加入細(xì)胞混懸液后放入凍存管中，于-80℃冰箱慢慢冷凍后，將凍存管置于液氮中保存，使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，需要時(shí)快速解凍。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。除此之外，還可以利用細(xì)胞凍存的形式來購買、寄增、交換和運(yùn)輸某些細(xì)胞。細(xì)胞凍存時(shí)加入保護(hù)劑終濃度5％-15％的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點(diǎn)降低，在緩慢凍結(jié)條件下，細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。采用″慢凍快融″的方法能較好地保證細(xì)胞存活。

若采用凍存技術(shù)凍存原代神經(jīng)元，不僅可解決分離成本，也可最大化地使用樣本材料。然而現(xiàn)有的利用二甲亞砜、血清混合液作為凍存液凍存原代神經(jīng)元時(shí)，往往對神經(jīng)元造成凍存損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元復(fù)蘇后無法繼續(xù)正常存活。低溫凍存對細(xì)胞產(chǎn)生的損傷主要有以下幾個(gè)方面：細(xì)胞流動性減小，細(xì)胞膜講話導(dǎo)致細(xì)胞的進(jìn)一步損傷，抑制了Na⁺/K⁺ATP酶，引起細(xì)胞膨脹；導(dǎo)致細(xì)胞壞死凋亡；產(chǎn)生氧自由基。如何減輕原代神經(jīng)元的低溫凍存的損傷，關(guān)鍵因素之一就是提供一種適宜的凍存液。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對傳統(tǒng)的凍存液無法避免神經(jīng)元凍存損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元存復(fù)蘇活率低、活性差的問題，提供一種神經(jīng)元凍存液及神經(jīng)元凍存、復(fù)蘇方法。

本發(fā)明提供的一種神經(jīng)元凍存液，所述神經(jīng)元凍存液包括以下體積份數(shù)的組分：45.00～55.00份神經(jīng)元培養(yǎng)基、40.50～49.50份10％牛血清白蛋白以及4.50～5.50份二甲基亞砜；所述神經(jīng)元凍存液不含有谷氨酰胺。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述神經(jīng)元培養(yǎng)基包括以下體積份數(shù)的組分：45.00～55.00份Neurobasal A培養(yǎng)基或Neurobasal培養(yǎng)基以及0.90～1.10份B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述神經(jīng)元培養(yǎng)基還包括以下體積份數(shù)的組分：0.27份～0.33份雙抗。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述Neurobasal A培養(yǎng)基為有糖型。

本發(fā)明還挺了一種神經(jīng)元凍存、復(fù)蘇方法，所述神經(jīng)元凍存、復(fù)蘇方法包括以下步驟：