[發明專利]一種神經元凍存液及神經元凍存、復蘇方法

有效

• 申請號: 201910516679.2
• 申請日: 2019-06-14
• 公開（公告）號: CN110338188B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 郭安臣;王群;王擁軍
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京天壇醫院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/0793
• 代理公司: 北京東方靈盾知識產權代理有限公司 11506
• 代理人: 蘇向銀;馬敬

1.一種神經元凍存液，其特征在于，所述神經元凍存液包括以下體積份數的組分：45.00～55.00份神經元培養基、40.50～49.50份10％牛血清白蛋白以及4.50～5.50份二甲基亞砜；所述神經元凍存液不含有谷氨酰胺；所述神經元培養基包括以下體積份數的組分：45.00～55.00份Neurobasal A培養基或Neurobasal培養基以及0.90～1.10份B27細胞培養添加劑。

2.根據權利要求1所述的神經元凍存液，其特征在于，所述神經元培養基還包括以下體積份數的組分：0.27份～0.33份雙抗。

3.根據權利要求1或2所述的神經元凍存液，其特征在于，所述Neurobasal A培養基為有糖型。

4.一種神經元凍存、復蘇方法，其特征在于，所述神經元凍存、復蘇方法包括以下步驟：

取樣：取離體哺乳動物的神經組織，剪碎后置于第一離心管中以800～1200rpm離心4～6min，去除離心上清液；

消化：向所述第一離心管中加胰酶，將所述第一離心管中的沉淀細胞吹開，抽出沉淀細胞置于消化培養皿中，向所述消化培養皿中追加胰酶，將所述消化培養皿放置于37℃培養箱中8～12min后，向所述消化培養皿中加入種植培養基終止消化；

制備細胞懸液：將所述消化培養皿中的混合物經細胞篩過濾后，以800～1200rpm離心4～6min，離心后去除上清液，制得原代神經元；

凍存：將所述原代神經元與如權利要求1至3任意一項所述的凍存液混合后制得凍存細胞液，將所述凍存細胞液置于凍存管中，于-20℃冰箱內冷凍1.0～2.0h后于-80℃冰箱內冷凍；

復蘇：將所述凍存管快速置于37℃水浴中速溶，將融解后的所述凍存細胞液以800～1200rpm離心4～6min，離心后去除上清液，制得凍存后神經元，將所述凍存后神經元轉入復蘇培養基培養或種植培養基培養。

5.根據權利要求4所述的神經元凍存、復蘇方法，其特征在于，在所述凍存步驟之前，還包括以下步驟：將所述原代神經元與所述種植培養基混合，以800～1200rpm離心4～6min，離心后去除上清液。

6.根據權利要求4所述的神經元凍存、復蘇方法，其特征在于，所述復蘇步驟中，將凍存后神經元轉入復蘇培養基培養或種植培養基培養之前，還包括以下步驟：將凍存后神經元與復蘇培養基混合，以800～1200rpm離心4～6min，離心后去除上清液。

7.根據權利要求4所述的神經元凍存、復蘇方法，其特征在于，所述神經組織包括海馬組織、大腦皮層、腦組織中的任意一種。

8.根據權利要求4所述的神經元凍存、復蘇方法，其特征在于，所述種植培養基包括以下體積份數的組分：36.53～45.87份DMEM培養基、4.50～5.50份馬血清以及2.70～3.30份胎牛血清。

9.根據權利要求4至8任意一項所述的神經元凍存、復蘇方法，其特征在于，在所述復蘇步驟中，將凍存后神經元轉入種植培養基培養4h，再換為神經元培養基培養。