[發明專利]一種基于G-四鏈體探針結構解旋的可視化識別microRNA的檢測方法

有效

• 申請號: 201910514343.2
• 申請日: 2019-06-14
• 公開（公告）號: CN110229872B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 程靚;蘭玲;劉利
• 申請（專利權）人: 中國科學院化學研究所
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 秦夢楠

本發明公開了一種基于G?四鏈體探針結構解旋的可視化識別microRNA的檢測方法。本發明將G?四鏈體與血紅素結合后的催化特性和G?四鏈體的結構變化進行結合構建的信號衰減方法能夠區分單堿基錯配和多堿基錯配的miRNA，同時能夠區分不同miRNA家族成員。在信號衰減的基礎上靈敏度仍能達到4.5nmol/L。本發明所使用探針設計簡單，不涉及復雜反應過程。本發明對于miRNA的檢測有重要意義。

技術領域

本發明涉及涉及核酸檢測領域，具體涉及一種基于G-四鏈體探針結構解旋的可視化識別microRNA的檢測方法。

背景技術

microRNA(以下簡稱miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中長度約22～23個核苷酸非編碼、單鏈小RNA。在不同細胞或組織類型中miRNA表達水平不同，廣泛參與不同的生理活動，其主要通過完全降解或翻譯抑制靶基因可以調控細胞增生、分化和凋亡。miRNA作為抑癌基因或原癌基因通過調節凋亡蛋白、激酶和其他腫瘤誘導因子等的表達來參與腫瘤的發生發展，因此異常的miRNA表達被認為是腫瘤或疾病的特征。

目前miRNA已經作為腫瘤分子標志物被用來研究腫瘤診斷和治療的靶點，那么關于miRNA的高靈敏檢測則為腫瘤早期診斷的重要依據。由于miRNA本身具有長度短，豐度低，易降解并且同源miRNAs相似度高的特點，現在大多數研究致力于信號放大或目標轉換的方法來彌補miRNA的缺陷，其中包括聚合酶鏈式反應(PCR)，滾環擴增反應(RCA)，納米粒子聚集和熒光能量轉移等方法，但這些方法反應過程復雜，制作費用高昂，不能全面滿足應用需求。為豐富現在已有的miRNA高靈敏檢測方法，同時為以后能選擇有效合適的檢測方法提供更多可能性，需要開發一種設計簡單，操作方便不依賴昂貴儀器，且高特異性識別miRNA的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于G-四鏈體探針結構解旋的可視化識別microRNA的檢測方法。

第一方面，本發明保護一種檢測microRNA的方法，包括如下步驟：合成探針；所述探針由結合區段和信號區段組成；所述結合區段為與目標microRNA的全長序列反向互補的DNA片段；所述信號區段為可形成G-四鏈體結構的DNA片段；

如果所述探針與待測樣本進行DNA/RNA雜化反應后可以招募DNA聚合酶對探針的G-四鏈體結構進行解旋復制使其轉變為雙鏈結構，則待測樣本中含有目標microRNA；反之，待測樣本中不含有目標microRNA。

進一步地，所述方法包括如下步驟：

(1)合成上述探針；

(2)取步驟(1)所述探針，經過退火使所述探針的信號區段形成G-四鏈體結構；

(3)將步驟(2)的探針與待測樣本進行DNA/RNA雜化反應；

(4)完成步驟(3)后，向反應體系中加入DNA聚合酶進行解旋擴增反應；

(5)完成步驟(4)后，向反應體系中加入血紅素進行反應；血紅素可與未解旋的G-四鏈體結構結合形成具有催化功能的復合物；

(6)完成步驟(5)后，向反應體系中加入ABTS和H₂O₂進行催化反應后檢測420nm處吸收值；

所述方法設置空白對照；所述空白對照采用水替代待測樣本；將待測樣本在420nm處吸收值記為A，將空白對照在420nm處吸收值記為A₀；A₀-A的數值越大，待測樣本中目標miRNA的含量越多。

同時，還可通過觀察空白對照的反應體系顏色和待測樣本的反應體系顏色來判斷目標miRNA的存在情況；空白對照的反應體系顏色為綠色，待測樣本的反應體系顏色與空白對照相比顏色越淺，待測樣本中目標miRNA的含量越多。