[發明專利]一種基于G-四鏈體探針結構解旋的可視化識別microRNA的檢測方法

有效

• 申請號: 201910514343.2
• 申請日: 2019-06-14
• 公開（公告）號: CN110229872B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 程靚;蘭玲;劉利
• 申請（專利權）人: 中國科學院化學研究所
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 秦夢楠

1.一種檢測microRNA的方法，包括如下步驟：合成探針；所述探針由結合區段和信號區段組成；所述結合區段為與目標microRNA的全長序列反向互補的DNA片段；所述信號區段為可形成G-四鏈體結構的DNA片段；

如果所述探針與待測樣本進行DNA/RNA雜化反應后可以招募DNA聚合酶對探針的G-四鏈體結構進行解旋復制使其轉變為雙鏈結構，則待測樣本中含有目標microRNA；反之，待測樣本中不含有目標microRNA；

所述方法為非疾病診斷的方法。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：

所述方法包括如下步驟：

(1)合成權利要求1中所述的探針；

(2)取步驟(1)所述探針，經過退火使所述探針的信號區段形成G-四鏈體結構；

(3)將步驟(2)的探針與待測樣本進行DNA/RNA雜化反應；

(4)完成步驟(3)后，向反應體系中加入DNA聚合酶進行解旋擴增反應；

(5)完成步驟(4)后，向反應體系中加入血紅素進行反應；血紅素可與未解旋的G-四鏈體結構結合形成具有催化功能的復合物；

(6)完成步驟(5)后，向反應體系中加入ABTS和H₂O₂進行催化反應后檢測420nm處吸收值；

所述方法設置空白對照；所述空白對照采用水替代待測樣本；將待測樣本在420nm處吸收值記為A，將空白對照在420nm處吸收值記為A₀；A₀-A的數值越大，待測樣本中目標miRNA的含量越多。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：

當選用的DNA聚合酶的復制方向是3′→5′時，所述探針自5’端至3’端依次為信號區段和結合區段；當選用的DNA聚合酶的復制方向是5′→3′時，所述探針自5’端至3’端依次為結合區段和信號區段。

4.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述探針的信號區段的長度小于30bp；所述信號區段形成G-四鏈體結構時，四聯體層數小于等于3。

5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述信號區段如序列表的序列1自5’端第1至19位所示。

6.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述DNA聚合酶為Klenow Fragment聚合酶。

7.如權利要求2所述的方法，其特征在于：

所述步驟(3)中，所述探針在DNA/RNA雜化反應體系中的濃度為0.5-1μmol/L；

和/或，所述雜化反應溫度為20℃-37℃；

和/或，所述雜化反應時間為60-120min；

所述步驟(4)中，所述DNA聚合酶在解旋擴增反應體系中的濃度為0.1-0.3unit/μL；

和/或，所述解旋擴增反應時間為40-60min；

所述步驟(5)中，所述血紅素在反應體系中的濃度為2-4μmol/L；

和/或，所述反應時間為1-2h；

和/或，所述反應溫度為20℃-37℃。

8.權利要求1至5中任一所述方法中的所述探針在制備試劑盒中的應用；所述試劑盒的用途為檢測目標microRNA。

9.一種檢測microRNA的試劑盒，含有權利要求1至5中任一所述方法中的所述探針。

10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還含有記載權利要求1至7任一所述方法的說明書。