[發明專利]一種雜交瘤細胞克隆化的方法

在審

• 申請號: 201910513374.6
• 申請日: 2019-06-14
• 公開（公告）號: CN110205301A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 陳志強
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 許必元

一種雜交瘤細胞克隆化的方法，屬于單克隆抗體的制備技術，用有限稀釋法對1個陽性孔進行1次克隆化操作需1～3塊96孔細胞培養板，而用單細胞顯微操作法進行克隆化時，每塊96孔細胞培養板可克隆化3～6個陽性孔，節省實驗材料；對于有限稀釋法，一般需進行2～3次或更多次克隆化才能基本保證雜交瘤細胞株的單克隆性，而對于單細胞顯微操作法，一般進行1次克隆化就能保證其單克隆性，節省了時間；與有限稀釋法相比較，單細胞顯微操作法顯然更能確保雜交瘤細胞株的單克隆性，方法更為可靠；相較于流式細胞分選，該方法科學、合理，不需要特殊儀器，操作簡單，更適合實驗室制備一般用途單抗。

技術領域

本發明屬于單克隆抗體的制備技術，涉及一種雜交瘤細胞克隆化的方法，具體的說是涉及一種利用顯微操作技術對篩選的陽性孔雜交瘤細胞進行克隆化的方法。

背景技術

抗體是外來大分子、微生物等抗原性物質進入動物機體后，由體內B淋巴細胞的終端分化細胞(漿細胞)所產生的一類糖蛋白。1975年，Kohler和Milstein 發明了單克隆抗體技術之后，單抗在疾病診斷和治療等臨床方面發揮著重要作用；此外，抗體作為一種免疫試劑在一般性科學研究中有著廣泛的應用，如免疫印跡、免疫組化、免疫熒光、免疫共沉淀。抗體是基礎科研和臨床分析最常用的工具之一。

目前，單克隆抗體制備及鑒定方法流程如圖1所示。首先，將抗原注入動物體內進行免疫；取出被免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合；然后，采用 ELISA法篩選融合孔細胞，并對篩選的陽性孔進行克隆化；進一步篩選克隆化的雜交瘤細胞，對篩選的陽性孔細胞進行擴大培養與凍存；接著，將雜交瘤細胞株注入動物體內誘生腹水來大量制備抗體，采用Protein A親和層析純化IgG₁類抗體；最后，對抗體進行全面的鑒定，包括亞型、效價、特異性、靈敏度、親和常數、抗體純度及分子量。

單克隆抗體制備過程復雜，實驗周期較長；其中雜交瘤細胞克隆化是單抗制備過程中最為繁瑣且耗時最多的步驟。細胞克隆化的方法主要包括有限稀釋法、流式細胞儀分選等。有限稀釋法是目前最為常用細胞克隆化的方法，操作步驟是將細胞進行梯度稀釋接種至96孔板。該方法對一個陽性孔細胞進行克隆化時，需要1-3塊96孔板，而且一般需要進行2-3次克隆化才能確保細胞的單克隆性。因此，有限稀釋法單克隆率低、工作量大、消耗時間長。流式細胞分選是一種高效的細胞克隆化方法，通過優化實驗體系即可對細胞進行大批量克隆化篩選，適用于醫藥等領域對抗體的需求。然而，對于制備一般用途抗體時，應用該方法顯然不劃算，且對儀器設備和操作人員要求較高。

發明內容

本發明的目的是針對上述現有技術的缺點和不足，提出一種雜交瘤細胞克隆化的方法，通過該方法可簡化雜交瘤細胞克隆化實驗流程，減少工作量，提高單克隆率，縮短實驗周期。

本發明的技術方案是：一種雜交瘤細胞克隆化的方法，其特征在于：所述克隆化的方法包括如下步驟：

(1)取一無菌平皿，加入3mL 37℃預熱的DMEM完全培養基；

(2)用槍頭輕輕吹吸，重懸細胞；吸取5～10μL細胞懸液加至平皿中；

(3)輕輕搖動平皿以混勻細胞，靜置3min，將平皿放在倒置顯微鏡下觀察，確保視野內只有1～2個可見的細胞；

(4)尋找亮而圓的細胞，用移液搶吸取單個細胞；

(5)將吸取的單個細胞加到鋪有飼養層細胞的96孔板中；

(6)將步驟(5)中的單個細胞置37℃、5％CO₂培養箱中培養。

步驟(1)中所述的平皿是直徑為6cm的圓形塑料皿，且對細胞沒有吸附性。

步驟(2)中所述的細胞為細胞融合后篩選的陽性孔內的雜交瘤細胞。