[發(fā)明專利]粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910509895.4
• 申請(qǐng)日: 2019-06-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112080553A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚瑤;金永生;李小明;靳彩娟;姚亦明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州融析生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851;C12Q1/6806
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責(zé)任公司 32102
• 代理人: 黃春松

本發(fā)明提供了一種粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測(cè)方法，通過(guò)處理粗品羊肝素鈉樣品，分別得到用于測(cè)量羊DNA和豬DNA的溶液；其中用于測(cè)量豬DNA的溶液采用單獨(dú)的試劑盒提取對(duì)豬DNA進(jìn)行提取；并針對(duì)待測(cè)DNA溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物、PCR反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)程序；最后分別使用羊DNA和豬DNA標(biāo)準(zhǔn)品制作相應(yīng)的DNA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用PCR擴(kuò)增制備的PCR模板，通過(guò)計(jì)算得到羊和豬DNA含量。本發(fā)明利用了TaqMan探針?lè)ㄟM(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單。通過(guò)肝素酶和硫酸軟骨素酶組合酶解粗品羊肝素鈉，有效解除了肝素、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素對(duì)PCR反應(yīng)的抑制；由于羊肝素鈉中豬DNA含量少，采用本發(fā)明提取方法，解決了微量豬DNA含量檢測(cè)準(zhǔn)確性問(wèn)題，效果顯著。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

肝素是臨床上應(yīng)用最廣泛且最重要的一種抗凝劑，主要提取自豬、牛和羊的腸粘膜或肺，目前醫(yī)用肝素的主要來(lái)源是豬的腸粘膜肝素，但牛、羊肝素在部分國(guó)家和地區(qū)(南美、東南亞與南亞)仍被廣泛使用。肝素通常是從刮制腸衣后的小腸粘膜中提取的，我國(guó)是世界最大的腸衣生產(chǎn)加工和出口國(guó)，每年有多達(dá)3億根的羊小腸被制成羊腸衣，大量的羊腸粘膜隨后被提取肝素，預(yù)估粗品羊肝素的總量在20噸左右。已有技術(shù)表明羊肝素在理化性質(zhì)和生物學(xué)活性上近似于豬肝素，專利CN2016106936194介紹了一種羊源的依諾肝素鈉，它是從粗品羊肝素鈉制備的低分子肝素，其除了種源為羊源外，符合USP依諾肝素鈉的質(zhì)量指標(biāo)。

眾所周知，穆斯林對(duì)食品和藥品有明確的要求，哺乳動(dòng)物牛、羊等可以食用，豬、狗等禁食，牛、羊肝素可開(kāi)發(fā)成清真藥物。通常意義上，牛源產(chǎn)品由于上世紀(jì)爆發(fā)的瘋牛病，存在一定的隱患，羊源肝素則讓人更容易接受一些。因此，檢測(cè)粗品羊肝素的質(zhì)量尤其是豬源肝素的混雜，是開(kāi)發(fā)清真肝素制品的必要程序。

在粗品肝素中，動(dòng)物組織中的部分DNA會(huì)在生產(chǎn)過(guò)程中保留下來(lái)。現(xiàn)有方法中，PCR方法用于快速檢測(cè)物種來(lái)源應(yīng)用比較廣泛。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)，通過(guò)最終Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)初始模板量進(jìn)行定量分析。熒光定量PCR技術(shù)具有高靈敏度，高精度等特點(diǎn)。現(xiàn)有熒光定量PCR技術(shù)均用于檢測(cè)豬肝素物料中豬和反芻基因的檢測(cè)，大多以總DNA提取的方法檢測(cè)其含量，專利CN201410115327.3中報(bào)道了使用肝素酶酶解肝素的方法用于鑒別豬肝素中的牛基因。

現(xiàn)有技術(shù)都不適用于羊肝素中羊DNA和豬DNA含量的檢測(cè)，主要原因在于：(1)粗品肝素中除了有肝素多糖還有硫酸軟骨素和硫酸皮膚素，它們都對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用；(2)羊源肝素中豬基因含量較少，不適合用酶解后的溶液直接測(cè)定含量，專利CN201610853008.1和CN201510179643.1中總DNA提取的方法也不適用。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)粗品羊肝素鈉中羊、豬DNA的qPCR方法，用于定量檢測(cè)粗品羊肝素中羊、豬DNA含量，監(jiān)控粗品羊肝素質(zhì)量。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

步驟一：處理粗品羊肝素鈉樣品，分別得到用于測(cè)量羊DNA和豬DNA的溶液其中用于測(cè)量豬DNA的溶液采用單獨(dú)的試劑盒提取對(duì)豬DNA進(jìn)行提取。其中，用于樣品中羊DNA含量的測(cè)定的處理，可通過(guò)處理粗品羊肝素鈉樣品，肝素酶II和硫酸軟骨素酶酶解樣品的方法，以降低肝素對(duì)于qPCR反應(yīng)的影響。而用于樣品中豬DNA含量的測(cè)定的處理則可以通過(guò)采用處理粗品羊肝素鈉樣品，肝素酶II酶解樣品，DNA試劑盒提取總DNA的方法進(jìn)行。