[發明專利]粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測方法

在審

• 申請號: 201910509895.4
• 申請日: 2019-06-13
• 公開（公告）號: CN112080553A
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發明（設計）人: 姚瑤;金永生;李小明;靳彩娟;姚亦明
• 申請（專利權）人: 蘇州融析生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6806
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 黃春松

1.粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一：處理粗品羊肝素鈉樣品，分別得到用于測量羊DNA和豬DNA的溶液；其中用于測量豬DNA的溶液采用單獨的試劑盒提取對豬DNA進行提??；

步驟二：針對待測DNA溶液進行PCR擴增設計引物、PCR反應體系及PCR反應程序；

步驟三：分別使用羊DNA和豬DNA標準品制作相應的DNA含量標準曲線，利用PCR擴增制備的PCR模板，通過計算得到羊和豬DNA含量。

2.根據權利要求1所述的粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測方法，其特征在于，步驟一用于制得測量羊DNA溶液的粗品羊肝素鈉的處理步驟為：

（1）稱取粗品羊肝素鈉溶于肝素酶消化緩沖液，95~100℃水浴溶解，冷卻至室溫后稀釋10倍混勻；

（2）將樣品溶液過微米級濾膜，經酶解體系：過濾后樣品溶液，肝素酶II，硫酸軟骨素酶，加消化緩沖液后震蕩搖勻，在23~28℃下水浴24小時；

（3）酶解液用無菌水稀釋制得用于羊DNA含量檢測的溶液。

3.根據權利要求1所述的粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測方法，其特征在于，步驟一中用于制得測量豬DNA溶液的粗品羊肝素鈉的處理步驟為：

（1）稱取粗品羊肝素鈉溶于肝素酶消化緩沖液，在95~100℃下水浴溶解，冷卻至室溫后稀釋10倍混勻；

（2）將樣品溶液過微米級濾膜，經過酶解體系：過濾后樣品溶液，肝素酶II，加消化緩沖液后震蕩搖勻，在23~28℃水浴下24小時；

（3）DNA試劑盒從酶解液中提取DNA用于豬DNA含量的檢測；

所述DNA提取包括如下步驟：①.將酶解液于制備管中，離心，棄廢液；②.加入BufferW1，再次離心，棄廢液；③.加Buffer W2，離心，棄廢液，重復一次；④.再次離心1min；⑤.轉制備管于新的離心管中，在制備管的膜中央加入Eluent溶液，65℃水浴靜置5min，經離心后即得。

4.根據權利要求1所述的粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測方法，其特征在于，所述步驟二中引物為：

其中，豬源引物：

上游引物：5＇-CCTACGCATTTCACTACAAG-3＇，

下游引物：5＇-GTTTGGGTTGATTGAATCTG-3＇，

探針引物：5＇-FAM -ACTAGCCCCATTATCAGTACTATGCCA-BHQ1-3＇；

其中，羊源引物：

上游引物：5＇-ACGAGGCCTATACTATGGATCATATACC-3＇，

下游引物：5＇-TCCTCATGGTAAAACATAGCCTATGAATG-3＇，

探針引物：5＇-FAM -CTCCTATTTGCGACAATAG-TAMRA-3＇。

5.根據權利要求1所述的粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測方法，其特征在于，所述步驟二中的PCR反應體系為：10×ExTaq Buffer，MgCl₂，dNTP，上游引物，下游引物，探針，ExTaq，ddH₂O，DNA/Sample。

6.根據權利要求1所述的粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測方法，其特征在于，所述步驟二中的PCR反應程序為：預變性 95℃ 10min；變性 95℃ 15s，退火 60℃1min，40個熱循環。

7.根據權利要求1所述的粗品羊肝素鈉中羊和豬基因含量的qPCR檢測方法，其特征在于，所述步驟三中羊和豬DNA含量標準曲線為通過各濃度DNA標準品溶液與其擴增曲線對應的Ct值，得出標準曲線，其中標準曲線的相關系數R的平方≥0.95，陰性對照的Ct值為NoCt。