[發明專利]一種用于檢測端粒酶活性的電化學傳感器及其檢測方法

有效

• 申請號: 201910506850.1
• 申請日: 2019-06-12
• 公開（公告）號: CN110243905B
• 公開（公告）日: 2021-08-17
• 發明（設計）人: 李金龍;楊永峰;張永臣;許傳軍;胡凱
• 申請（專利權）人: 南京市第二醫院;南京鼓樓醫院
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/38;G01N27/48
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馮慧

本發明基于功能化的納米磁珠和核酸外切酶III輔助的放大策略構建了一種用于檢測端粒酶活性的電化學傳感器及其檢測方法，實現了對腫瘤細胞端粒酶活性的檢測。在本發明中，互補的探針可以與延長的端粒酶引物重復序列雜交，雜交產物通過磁珠分離，端粒酶引物重復序列鏈被核酸外切酶Ⅲ識別和降解，釋放的互補探針能夠雜交并打開多個亞甲基藍標記的發夾DNA探針，經過核酸外切酶III的二次降解后，互補探針又可以進入下一個與MB標記的發夾樣結構雜交的循環，而MB標記的探針與金電極表面的捕獲探針結合，從而產生與端粒酶活性呈正比的峰電流值，本發明的電化學傳感器及其檢測方法能夠在單細胞水平檢測端粒酶活性。

技術領域

本發明涉及端粒酶電化學檢測領域，特別是涉及一種基用于檢測端粒酶活性的電化學傳感器及其檢測方法。

背景技術

端粒末端轉移酶，簡稱端粒酶，最初是在單細胞生物(四膜蟲)中發現的，端粒酶是一種核糖核蛋白逆轉錄酶，能夠將TTAGGG重復序列加到染色體DNA的端粒末端。發現近十年后，端粒酶被認為是人類癌癥的一個普遍的生物標志物，眾所周知，隨著年齡的增加，端粒逐漸縮短，通過激活或上調端粒酶等一系列的變化，具有短端粒的細胞逃避衰老成為永生細胞。大多數人類腫瘤細胞(85％–90％)高表達端粒酶，而在大多數正常組織或者細胞端粒酶活性是缺失的或被高度抑制的，使端粒酶成為癌癥治療的一個有吸引力的目標和腫瘤早期診斷的一種有價值的腫瘤標志蛋白。研究表明端粒酶的異常表達在肝癌的發生、發展過程中起著關鍵作用，研究者對肝癌組織端粒酶活性的體外研究表明，肝癌中端粒酶陽性率明顯高于慢性肝炎組織、肝硬化組織和癌旁組織，而正常肝組織并沒有端粒酶活性，因此端粒酶的檢測對于肝癌的早期診斷、治療具有重要意義。

迄今為止，研究者已開發出多種端粒酶活性檢測的方法，在這些方法中，以端粒重復擴增序列(TRAP)為基礎的聚合酶鏈式反應(PCR)被認為是最廣泛使用的方法。然而，許多細胞裂解物中含有Taq DNA聚合酶的抑制劑，這可能會導致假陰性結果。因此，近年來發展了很多PCR的替代方法，包括比色法、熒光法、化學發光法，電化學方法和表面等離子共振法等，其中電化學方法具有微型化和高靈敏度的優點，在實際應用中具有顯著的優越性。

如中國專利CN201510346698.7公開了一種用于檢測端粒酶活性的電化學傳感器及其制備方法，該電化學傳感器制備的主要過程是，在二硫化鉬納米片表面依次吸附硫堇、Au@SiO₂、富G結構的DNA鏈S1，通過加入Hemin形成MoS₂-Thi-Au@SiO₂/DNAzyme納米復合材料，在金電極表面修飾TS前體，利用端粒酶延長DNA鏈形成S2，并與S1互補螺旋，最終通過檢測催化過氧化氫氧化ABTS的電化學信號強弱來實現對端粒酶活性的直接檢測，該發明制備的電化學傳感器操作簡單，靈敏度高，穩定性強。

再如中國專利CN201710857470.3公開了一種基于電化學發光級聯放大原理的端粒酶活性檢測方法，本發明利用端粒酶能執行添加重復序列的性能，結合電化學發光放大信號基團線性及樹狀三聯吡啶釕聚合物電化學發光方法，提出了基于電化學發光級聯放大原理的高靈敏度端粒酶活性檢測方法，該發明檢測過程簡單、快速，經過簡單的端粒酶提取過程即可進行端粒酶活性監測，耗時短，省去了擴增步驟，檢測快速，同時成本低。

盡管使用不同的電化學方法來檢測端粒酶活性已經取得了巨大的進步，但在電極表面，端粒酶對引物的識別能力有限，電極表面的空間位阻效應使得這些非均相實驗的結合效率和酶動力學相對較低。同時由于細胞裂解液中含有多重酶蛋白，容易對端粒酶的延伸產物產生降解作用，不利于端粒酶活性的真實檢測。

本發明基于磁珠(Magnetic beads,MB)和核酸外切酶III輔助的信號放大策略提出了一種均相、簡單、快速、高靈敏用于檢測端粒酶活性的電化學傳感器和檢測方法。

發明內容

針對上述現有技術的不足，本發明的第一個目的在于提供一組用于檢測端粒酶活性的探針，具體序列如下：