[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)端粒酶活性的電化學(xué)傳感器及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910506850.1
• 申請(qǐng)日: 2019-06-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110243905B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李金龍;楊永峰;張永臣;許傳軍;胡凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京市第二醫(yī)院;南京鼓樓醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N27/327
• 分類號(hào): G01N27/327;G01N27/38;G01N27/48
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馮慧

1.一種端粒酶活性的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于，包含以下步驟：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)及端粒酶的提取；

(2)金電極處理和DNA的固定；

1)金電極預(yù)處理：

a)金電極用氧化鋁粉末拋光，得到拋光后的電極；

所述金電極直徑：

b)將步驟a)中拋光后的電極浸泡在水虎魚(yú)溶液中2-20min消除吸附的有機(jī)物，并用去離子水徹底清洗；

所述水虎魚(yú)溶液具體為V(H₂SO₄)：(30％H₂O₂)＝3：1；

c)再將電極用50％硝酸浸泡10-30min，然后分別用乙醇和去離子水處理電極2-8min，再用氮?dú)獯蹈珊螅瑢㈦姌O浸入0.5M硫酸中，用循環(huán)伏安法(CV)從0到1.6V進(jìn)行掃描直到獲得穩(wěn)定的信號(hào)；

2)將含巰基標(biāo)記捕獲探針的DNA固定化緩沖液滴加在金電極表面，在潮濕條件下孵育8-16h，捕獲探針一端的巰基通過(guò)Au-S鍵連接到金電極表面，然后對(duì)修飾的金電極進(jìn)行沖洗，在電極表面滴入含1mMMCH的Tris-HCl，孵育8-20min；

所述捕獲探針的具體序列如下：

捕獲探針(DNAS1)，SEQ ID NO.3：5′-GGTACATT-SH-3′；

3)將沒(méi)有被捕獲探針結(jié)合的金電極表面封閉起來(lái)，以形成良好的無(wú)非特異性吸附的自組裝單分子層；

(3)端粒酶活性的電化學(xué)檢測(cè)；

1)將10μL端粒酶提取物添加到40μL含有2mM互補(bǔ)探針的延伸溶液中，在37℃反應(yīng)2h，制得磁珠-DNA復(fù)合物；

所述互補(bǔ)探針的具體序列如下：

SEQ ID NO.4：5′-CCCTAACCCTAA-3′；

2)將步驟1)制得的磁珠-DNA復(fù)合物收集，用PBS沖洗，然后加入反應(yīng)緩沖液，重懸磁珠(MB)-DNA復(fù)合物，并加入發(fā)夾樣探針(HP)，核酸外切酶III(ExonucleaseIII,ExoIII)，在25℃孵育20-60min，制得混合物；

所述發(fā)夾樣探針(HP)具體序列如下：

SEQ ID NO.2：5′-MB-TTTGTACCCTTTTGTGAGTTGGTTAGGGTTAGGG-3′；

3)將步驟2)制得的混合物與捕獲探針修飾的金電極共孵育1-4h，之后徹底清洗去除多余的DNA，制得電化學(xué)傳感器，即可對(duì)端粒酶活性進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

2.如權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)檢測(cè)方法，其中步驟(1)細(xì)胞培養(yǎng)及端粒酶的提取，具體步驟如下：

1)HeLa細(xì)胞培養(yǎng)；

2)細(xì)胞懸浮分散處理：將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用PBS洗滌，用胰蛋白酶消化1-3min后，再用PBS緩沖液吹打細(xì)胞，使其脫離，制得脫壁細(xì)胞；

3)端粒酶提取：收集步驟2)制得的脫壁細(xì)胞，離心、重懸并冰浴10-50min，將含有細(xì)胞的裂解液在4℃的溫度下離心，收集上清液，測(cè)定蛋白濃度，所提取物立即使用或儲(chǔ)存在-80℃。

3.如權(quán)利要求2所述的一種電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于：

步驟1)中，HeLa細(xì)胞培養(yǎng)的條件為：37℃，5％CO₂培養(yǎng)條件下用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；

步驟3)中，首次離心為1000rpm離心5min；

步驟3)中，冰浴時(shí)間為30min；

步驟3)中，第二次離心為12000rpm離心30min；

步驟3)中，用200μL冰凍的1×CHAPS裂解緩沖液重懸；

步驟3)中，用Eppendorf管收集上清液。

4.如權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于：

步驟(2)-1)-a)中，氧化鋁粉末的粒子大小為1.0、0.3和0.05μm；

步驟(2)-2)中，用1μM的巰基標(biāo)記捕獲探針；

步驟(2)-2)中，在潮濕條件下孵育12h；

步驟(2)-2)中，在電極表面滴入含1mM MCH的10μL Tris-HCl，孵育15min；

所述Tris-HCl溶液的濃度為10mM。