[發(fā)明專利]一種基于全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選異種移植抗原基因的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910497797.3
• 申請(qǐng)日: 2019-06-10
• 公開（公告）號(hào): CN110358766A
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏紅江;趙恒;李鴻輝;角德靈;趙紅業(yè)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/90;C12N15/867;C12N15/65
• 代理公司: 北京名華博信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11453
• 代理人: 李中強(qiáng)

本發(fā)明涉及一種基于全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選異種移植抗原基因的方法，屬動(dòng)物基因編輯技術(shù)領(lǐng)域。基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，針對(duì)豬基因組范圍內(nèi)的全部基因各設(shè)計(jì)1?2條靶向sgRNA，構(gòu)建sgRNA慢病毒載體隨機(jī)敲除文庫并轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，收集病毒再轉(zhuǎn)染至豬PK15細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)入病毒的豬PK15細(xì)胞包被到靈長(zhǎng)類的胸腺或腎包膜下，或用人血清進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別在不同的時(shí)間內(nèi)回收存活的細(xì)胞，再對(duì)回收的活細(xì)胞建立單細(xì)胞DNA文庫或進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后提取DNA，再用慢病毒載體上的通用引物擴(kuò)增含有sgRNA的上述DNA片段，對(duì)敲除的單細(xì)胞基因位點(diǎn)進(jìn)行定型，最終確定并查找出相關(guān)基因的信息。本發(fā)明的實(shí)施對(duì)豬作為異種器官移植過程中豬細(xì)胞表面新抗原的挖掘具有重要的指導(dǎo)意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選異種移植抗原基因的方法。

背景技術(shù)

器官移植作為治療終末端器官衰竭患者的一種有效途徑，在臨床上得到了廣泛應(yīng)用。然而，我國目前每年可以實(shí)施臨床器官移植的數(shù)量約為1萬例，而等待器官移植的病人則有150萬，等待器官移植與可進(jìn)行器官移植患者的數(shù)量比值為150:1，器官短缺的形勢(shì)依然很嚴(yán)峻。近年來，隨著我國心臟病以及糖尿病等疾病患者的大幅增長(zhǎng)，使得發(fā)展成為終末期腎、心、胰島等組織器官衰竭的病人正在或?qū)⒓眲≡黾樱瑢?duì)器官移植需求的壓力也將越來越大。而且，從2015年1月1日起，我國已經(jīng)全面停止使用死囚器官作為移植供體來源，公民去世后自愿器官捐獻(xiàn)將成為我國器官移植使用的最終來源，這勢(shì)必導(dǎo)致器官供體本已日益短缺的形勢(shì)更加嚴(yán)峻。因此，器官的嚴(yán)重短缺，最終將給病人家庭、社會(huì)和國家?guī)沓林刎?fù)擔(dān)，已成為全球性的社會(huì)問題，尋找新的供體來源來解決目前器官短缺的難題是當(dāng)今社會(huì)面臨的首要問題。目前，異種器官移植被公認(rèn)為解決全球人類器官供體嚴(yán)重不足的有效途徑，更有甚者認(rèn)為是唯一途徑。

談到異種移植，人們首先都會(huì)想到并認(rèn)為與人類血緣系統(tǒng)最為接近的非人類靈長(zhǎng)類是最佳的供體源，但作為臨床異種移植供體，非人類靈長(zhǎng)類存在諸如倫理問題、高風(fēng)險(xiǎn)交聯(lián)物種傳播感染、性成熟晚、與人類的器官大小不匹配，不易操作等問題。因此，非靈長(zhǎng)類并不被認(rèn)為是異種器官移植的合適供體（Cooper et al., 2002；Yang and Sykes, 2007；Ekser et al., 2012）。豬易于飼養(yǎng)、繁殖快、器官大小與人類相匹配，生理和代謝方面與人類相近，人-豬共患病發(fā)生的可能性較小，涉及倫理問題較少，并可通過基因修飾來增強(qiáng)供體器官的匹配性（Vodicka et al., 2005; Lutz et al., 2013）。因此，豬被公認(rèn)是最適合用作異種移植供體的物種。

目前，針對(duì)豬作為異種器官移植過程中存在的生物安全、免疫排斥反應(yīng)及器官功能障礙的三大共性問題，研究者已利用基因編輯技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)相結(jié)合的方法產(chǎn)生了不同基因修飾的克隆豬，在一定程度上克服異種移植物的免疫排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)器官移植的存活時(shí)間。然而，異種移植過程中仍面臨著很多由抗原抗體引起的免疫排斥反應(yīng)。因豬細(xì)胞表面本身攜帶有大量抗原具有，且大部分抗原還未被檢測(cè)到（Byrne et al., 2013），對(duì)其進(jìn)行基因編輯修飾較困難。因此，在未知豬抗原信息及數(shù)量的前提下，基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，通過在豬基因組中構(gòu)建針對(duì)不同基因敲除的sgRNA病毒載體文庫，對(duì)豬細(xì)胞中異種抗原基因進(jìn)行敲除，利用全基因組測(cè)序的方法確定豬細(xì)胞表面多種異種移植抗原基因的信息。這將最大限度地挖掘出異種移植過程中豬細(xì)胞表面的新抗原，為進(jìn)一步對(duì)抗原基因的編輯和修飾奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)以上問題，本發(fā)明提供了一種基于全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選異種移植抗原基因的方法，本方法在未知豬抗原信息及數(shù)量的前提下，基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，通過在豬基因組中構(gòu)建針對(duì)不同基因敲除的sgRNA病毒載體文庫，對(duì)豬細(xì)胞中異種抗原基因進(jìn)行敲除，利用全基因組測(cè)序的方法確定豬細(xì)胞表面多種異種移植抗原基因的信息。這將最大限度地挖掘出異種移植過程中豬細(xì)胞表面的新抗原，節(jié)省抗原的篩選時(shí)間和節(jié)約經(jīng)費(fèi)投入，對(duì)開發(fā)異種器官移植供體豬抗原基因的修飾具有重大的意義。