[發明專利]一種基于全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選異種移植抗原基因的方法

在審

• 申請號: 201910497797.3
• 申請日: 2019-06-10
• 公開（公告）號: CN110358766A
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發明（設計）人: 魏紅江;趙恒;李鴻輝;角德靈;趙紅業
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N15/867;C12N15/65
• 代理公司: 北京名華博信知識產權代理有限公司 11453
• 代理人: 李中強

1.一種基于全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選異種移植抗原基因的方法，其特征在于：具體步驟為：

1）文庫設計

根據NCBI上豬的全基因組序列，基于CRISPR/Cas9基因編輯系統，對豬基因組中各個基

因信息各設計1-2個靶向sgRNA序列，構建sgRNA敲除文庫；

2）病毒載體的包被

利用CustomArray芯片合成儀合成Array sgRNA oligo并對其進行純化，再用PhusionHS

Flex引物擴增sgRNA oligo并膠回收目的片段；lenti-CRISPR-GFP載體在限制性內切酶BsmBI的作用下酶切后并回收目的酶切載體；在Gibson ligation重組酶的作用下，將上述酶切載體與回收片段進行重組，所獲得的重組載體再轉染至electrocompetent cell中，再將轉化產物涂到羧芐青霉素的平板中，挑取單克隆擴增后提取無內毒素重組質粒，將質粒轉染至HEK293T細胞中，60h后收集上清獲得病毒載體；

3）病毒載體的轉染

將不同的病毒量轉染至豬PK15細胞，檢測GFP表達量MOI，根據MOI值確定豬PK15細胞最佳的病毒體積，再按最佳病毒體積將病毒載體感染至PK15細胞，48h后，觀察細胞GFP的表達率，并進一步確定病毒感染滴度；

4）文庫的篩選

將病毒載體感染的PK15細胞經離心后吸棄上清液，換液后培養7天，將7天后存活的細胞或流式分選后培養數天的GPF陽性細胞移植到腎包膜或胸腺下，移植后收集GFP陽性細胞或存活細胞；將換液后培養7天后的細胞或GFP陽性細胞在人血清中培養3.5-12h，收集存活細胞經流式分選獲得GFP陽性細胞或直接收集GFP存活細胞；將上述回收的細胞進行單細胞擴增后提取DNA，PCR擴增sgRNA區域選定打靶基因，TA克隆后測序。

2.根據權利要求1所述的一種基于全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選異種移植抗原基因的方法，其特征在于：步驟1）中，所述的sgRNA設計不使用4個堿基連續出現的結構，且GC含量大于50%，兩個sgRNA打靶PAM之間的距離在30bp以上。

3.根據權利要求1所述的一種基于全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選異種移植抗原基因的方法，其特征在于：步驟1）中，所述的文庫覆蓋度大于166X。

4.根據權利要求1所述的一種基于全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選異種移植抗原基因的方法，其特征在于：步驟2）中，所述的sgRNA oligo膠回收片段大小為128bp，lenti-CRISPR-GFP載體的酶切產物膠回收片段大小為12983bp。