[發明專利]檢測新城疫病毒抗體的多肽及其ELISA檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201910496410.2
• 申請日: 2019-06-10
• 公開（公告）號: CN110240635B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 張安定;成澤;任海洋
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C07K14/125
• 分類號: C07K14/125;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平;馮超

本發明公開一種檢測新城疫病毒抗體的多肽及其ELISA檢測試劑盒，該試劑盒通過篩選的新城疫病毒HN蛋白的多肽包被酶標板，通過檢測樣品中血清抗體與多肽的結合能力，借助于辣根過氧化物酶標記的羊抗雞Igγ的抗體，來檢測血清中新城疫病毒抗體水平。該試劑盒檢測禽流感病毒H5、H7、H9亞型抗體、雞傳染性法氏囊病病毒抗體、雞傳染性支氣管炎病毒抗體均為陰性。該試劑盒可檢測血凝抑制(HI)效價大于或等于4log₂的血清，符合臨床血清檢測靈敏度的要求。與血凝抑制方法同時檢測臨床血清時，其符合率高達98.7％。且操作簡便，無特殊材料要求，結果判定客觀性好，不受操作人員主觀判定的影響。適合作為新城疫疫苗免疫后抗體水平檢測和監測的工具。

技術領域

本發明涉及農業生物技術領域，具體涉及一種檢測新城疫病毒抗體的多肽及其ELISA檢測試劑盒。

背景技術

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒引起的雞和多種禽類的急性高度接觸性傳染病，該病傳播迅速，病死率高，是危害養禽業的重大疫病之一。本病的主要特征是呼吸困難、腹瀉、神經紊亂、黏膜和漿膜出血。該病可造成重大的經濟損失，被OIE規定為必須報告的疫病，因此世界各國對本病的發生和流行均高度重視。

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬于副黏病毒科、禽腮腺炎病毒屬，完整病毒粒子近圓形，直徑為100～500nm。該病毒具有囊膜結構，病毒核酸類型為單股不分節段的RNA，在NDV基因組上依次排列著NP、P、M、F、HN和L基因，分別編碼核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)。NP蛋白是一種與病毒增殖密切相關的蛋白，對病毒核衣殼的形成至關重要，它可以包裹基因組RNA形成一個螺旋的核衣殼，對病毒RNA有保護作用。P蛋白位于核衣殼內，是RNA依賴的RNA聚合酶的兩個亞單位之一，主要作用是參與病毒基因組的復制和轉錄。此外，P蛋白還通過其N端與新城疫病毒的N蛋白結合，抑制N蛋白的自我裝配，從而防止不含病毒RNA的核衣殼的形成。M蛋白是存在于病毒囊膜內層的一種非糖基化蛋白，在病毒裝配的過程中對病毒囊膜的形成、核衣殼與囊膜之間的識別、維持病毒粒子結構完整性有著重要的作用。F蛋白為NDV主要的結構蛋白，位于病毒囊膜上，負責病毒與易感細胞發生融合，從而使病毒進入細胞并產生溶血現象，其蛋白裂解位點與病毒毒力有關。HN蛋白是一種既有血凝素(HA)活性又有神經氨酸酶(NA)活性的糖蛋白，是NDV重要的毒力蛋白和保護性抗原，與F基因共同決定著NDV的毒力強弱。L蛋白為NDV最大的蛋白，它是RNA依賴性的RNA聚合酶的主要組成部分，可與NP蛋白和P蛋白共同構成病毒復制復合體，該復合體參與病毒基因組的轉錄和復制。

目前，我國對于新城疫的防控采取了以疫苗免疫為主的綜合性防控措施。長期以來對疫苗免疫效果的評估主要采用血凝抑制試驗的方法，認為血凝抑制效價大于或等于4log₂判定為抗體水平陽性，免疫合格；血凝抑制效價小于4log₂則判定為抗體水平陰性；通常認為血凝抑制效價達到1:8log₂及以上時，則具有高抗體水平。但該方法需要新鮮制備的雞紅細胞，從而涉及復雜的生物材料獲取，而且雞紅細胞的質量對結果的評定影響較大；操作時需要倍比稀釋血清且步驟較多，導致該方法操作時比較復雜，尤其常規檢測或監測抗體水平時通常涉及非常多的樣品，從而導致該方法需要極大的工作量，造成很大的困難；另外，該方法的結果判定時受紅細胞質量、人為主觀判定因素等影響較大，導致結果判定通常存在一定的差異性。

長期以來，研究人員一直試圖開發一種簡便、易于標準化、適合大量血清樣品檢測的方法。ELISA技術是一種常用的、標準化、較為靈敏、且適合大量血清樣品檢測的技術。但長期以來，前期開發的檢測新城疫病毒血清抗體水平的ELISA檢測試劑盒其要么靈敏度不能達到臨床要求(血凝抑制效價4log₂)，要么特異性不佳(與其他雞病原的抗體有交叉反應)。

發明內容