[發明專利]從腫瘤組織檢測ALK基因融合變異的方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201910494165.1
• 申請日: 2019-06-09
• 公開（公告）號: CN110218794A
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 班貴宏;祝令香;郭永;盧臨萍;楊文軍;高娜
• 申請（專利權）人: 新羿制造科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種從腫瘤組織檢測ALK基因融合變異的方法及其試劑盒。該方法對ALK基因斷裂位點的5’端外顯子區和3’端外顯子區的表達量進行檢測，ALK基因上游引物和下游引物分別位于5’端外顯子區和3’端外顯子區待擴增測靶標區域的兩端，所述上游引物、下游引物和/或探針的部分序列跨所述二個相鄰外顯子拼接區域，使上下游引物之間的待擴增測靶標區域至少包括一個所述二個相鄰外顯子拼接區域；所述ALK基因的5’端外顯子區和3’端外顯子區表達量均用所述參照基因進行歸一化分析。本發明的方法可以簡便快速檢測ALK基因由于基因融合而產生的變異，無論是由哪種伴侶融合造成的ALK融合，均可以進行準確檢測，為靶向藥物ALK抑制劑的臨床治療應用提供指導。

技術領域

本發明涉及數字PCR技術領域，具體涉及一種從腫瘤組織檢測ALK基因融合變異的方法及其試劑盒。

背景技術

間變淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)融合基因是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中第二常見的驅動基因，在中國NSCLC患者中的突變率為5.3％左右。ALK激酶域共有10個外顯子(EXON20-29)，最常見的EML4融合發生在EXON20外顯子上。目前發現EML4-ALK有30多種融合形式，其他的融合伴侶基因還有KIF5B、TFG、KLC1和PTN3等，目前已報道有30多種。目前ALK基因融合常見的方法主要有熒光原位雜交(FISH)、免疫組化(ICH)、逆轉錄熒光PCR(RT-PCR)和二代測序(NGS)等方法，這些方法都有不同程度的漏檢，有些方法檢測流程復雜。除了腦組織之外，ALK基因表達量自出生后下降至低水平，在正常的肺組織中并不表達，其3'端酪氨酸激酶區可與多種伴侶發生融合，使ALK基因的3'端實現了高表達。正是基于ALK基因融合后這一表達特點，本發明設計了通過檢測ALK基因mRNA的斷裂位點之后的3’端表達量與斷裂位點之前的5’端表達量的定量差異來檢測融合突變。

發明內容

為了解決上述關鍵問題，本發明提供一種從腫瘤組織檢測ALK基因融合變異的方法，所述方法包括以下步驟：步驟1：從腫瘤組織獲得RNA樣本；步驟2：在ALK基因mRNA斷裂位置之前的5’端和之后的3'端的至少二個相鄰外顯子區域和參照基因mRNA中分別篩選待測靶標區域；步驟3：對步驟2中篩選的靶標區域分別設計相應的引物對和探針，其中ALK基因mRNA斷裂位置之前的5’端和之后的3'端外顯子區的上游引物和下游引物分別位于待擴增測靶標區域的兩端，所述上游引物、下游引物和/或探針的部分序列跨所述二個相鄰外顯子拼接區域，使上下游引物之間的待擴增測靶標區域至少包括一個所述二個相鄰外顯子拼接區域；所述ALK基因mRNA斷裂位置之前的5’端和之后的3'端外顯子區的的探針和所述參照基因的探針分別用不同的熒光基團進行標記；步驟4：對步驟2中所述篩選的待測靶標區域進行微滴式數字PCR擴增；和步驟5：根據所述ALK基因mRNA斷裂位置之前的5’端和之后的3'端外顯子區的和所述參照基因的不同熒光染料標記的陽性PCR產物液滴數的比例，來判斷腫瘤組織是否存在ALK基因融合變異。

在一種實施方式中，步驟3中設計ALK基因mRNA斷裂位置之后的3'端外顯子區的引物對和探針時，引物和探針的位置可以在20外顯子之后的區域；ALK基因mRNA斷裂位置之前的5'端外顯子區的引物對和探針時，引物和探針的位置可以在20外顯子之前的區域。

在一種實施方式中，步驟3中設計ALK基因mRNA斷裂位置之后的3'端外顯子區的引物和探針時，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外顯子23，下游引物位于ALK基因外顯子24，所述探針位于ALK基因外顯子23-24拼接區域。

在一種實施方式中，所述ALK基因上游引物為SEQ ID NO：1：TCTGAACAGGACGAACTGGA；所述ALK基因下游引物為SEQ ID NO：2：TGGTGGTTGAATTTGCTGA；和所述ALK基因探針為SEQ ID NO：9：CTCATGGAAGCCC。