[發明專利]從腫瘤組織檢測ALK基因融合變異的方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201910494165.1
• 申請日: 2019-06-09
• 公開（公告）號: CN110218794A
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 班貴宏;祝令香;郭永;盧臨萍;楊文軍;高娜
• 申請（專利權）人: 新羿制造科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種從腫瘤組織檢測ALK基因融合變異的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

步驟1：從腫瘤組織獲得RNA樣本；

步驟2：在ALK基因mRNA斷裂位置之前的5’端和之后的3'端的至少二個相鄰外顯子區域和參照基因mRNA中分別篩選待測靶標區域；

步驟3：對步驟2中篩選的靶標區域分別設計相應的引物對和探針，其中ALK基因mRNA斷裂位置之前的5’端和之后的3'端外顯子區的上游引物和下游引物分別位于待擴增測靶標區域的兩端，所述上游引物、下游引物和/或探針的部分序列跨所述二個相鄰外顯子拼接區域，使上下游引物之間的待擴增測靶標區域至少包括一個所述二個相鄰外顯子拼接區域；所述ALK基因mRNA斷裂位置之前的5’端和之后的3'端外顯子區的的探針和所述參照基因的探針分別用不同的熒光基團進行標記；

步驟4：對步驟2中所述篩選的待測靶標區域進行微滴式數字PCR擴增；和

步驟5：根據所述ALK基因mRNA斷裂位置之前的5’端和之后的3'端外顯子區的和所述參照基因的不同熒光染料標記的陽性PCR產物液滴數的比例，來判斷腫瘤組織是否存在ALK基因融合變異。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3中設計ALK基因mRNA斷裂位置之后的3'端外顯子區的引物對和探針時，引物和探針的位置可以在20外顯子之后的區域；ALK基因mRNA斷裂位置之前的5'端外顯子區的引物對和探針時，引物和探針的位置可以在20外顯子之前的區域。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3中設計ALK基因mRNA斷裂位置之后的3'端外顯子區的引物和探針時，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外顯子23，下游引物位于ALK基因外顯子24，所述探針位于ALK基因外顯子23-24拼接區域。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述ALK基因上游引物為SEQ ID NO：1：TCTGAACAGGACGAACTGGA；所述ALK基因下游引物為SEQ ID NO：2：TGGTGGTTGAATTTGCTGA；和所述ALK基因探針為SEQ ID NO：9：CTCATGGAAGCCC。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3中設計ALK基因mRNA斷裂位置之后的3'端外顯子區的引物和探針時，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外顯子24，下游引物位于ALK基因外顯子25，所述探針位于ALK基因外顯子24-25拼接區域。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述ALK基因上游引物為SEQ ID NO：3：TCAGTATTTGGAGGAAAACCACT；所述ALK基因下游引物為SEQ ID NO：4：CCCAGAGGCCTTCATGGA；和所述ALK基因探針為SEQ ID NO：10：TGGCAGCAATGTCT。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3中設計ALK基因mRNA斷裂位置之后的3'端外顯子區的引物和探針時，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外顯子26，下游引物位于ALK基因外顯子27，所述探針位于ALK基因外顯子26-27拼接區域。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述ALK基因上游引物為SEQ ID NO：5：TGGACAGGTCAAGAGGCA；所述ALK基因下游引物為SEQ ID NO：6：CCATAGCAGCACTCCAAAG；和所述ALK基因探針為SEQ ID NO：11：CATGTGTCTGTTTTAGAAG。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3中設計ALK基因mRNA斷裂位置之前的5'端外顯子區的的引物對和探針時，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外顯子17，下游引物位于ALK基因外顯子18，所述探針位于ALK基因外顯子17-18拼接區域。