[發明專利]一種基于脾臟代謝組學研究硒化氨基多糖對黑鯛免疫機制增強模型的構建方法

有效

• 申請號: 201910491370.2
• 申請日: 2019-06-06
• 公開（公告）號: CN110346464B
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發明（設計）人: 周秀錦;邵宏宏;張靜;晁鐸源;宋立玲
• 申請（專利權）人: 舟山出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/34;G01N30/86;G01N30/88
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

1.一種基于脾臟代謝組學研究硒化氨基多糖對黑鯛免疫機制增強模型的構建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

1)將用于動物實驗的黑鯛幼魚隨機均分為實驗組和空白組；

2)采用相同的飼料飼喂實驗組和空白組，并在實驗組的飼料中加入硒化氨基多糖；

3)飼喂結束后將實驗組和空白組的黑鯛幼魚進行饑餓處理，并用麻醉劑麻醉后，取出脾臟組織，保存備用；

4)制備脾臟組織樣品和質控樣品，隨后使用超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術進行處理，其中，在液相色譜中C₁₈和HILIC兩種色譜柱結合使用，進樣時質控樣品穿插于脾臟組織樣品之間；

C₁₈色譜柱色譜條件為：流動相A為2mmol/L甲酸銨和0.05％甲酸水溶液，流動相B為乙腈和間苯二甲酸混合液，且乙腈和間苯二甲酸的體積比為1:1，流動相梯度洗脫如下表所示：

HILIC色譜柱色譜條件為：流動相C為10mmol/L甲酸銨和0.1％甲酸水溶液，流動相D為乙腈水溶液，其中乙腈和水體積比為95:5，且水中含有10mmol/L甲酸銨和0.1％甲酸，流動相梯度洗脫如下表所示：

5)對超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術所收集得到的黑鯛脾臟代謝組學數據進行分析處理，識別并篩選出關于硒化氨基多糖對黑鯛免疫機制增強的脾臟代謝組學生物標志物，并對脾臟代謝組學生物標志物指向的代謝通路進行構建和分析；

所述生物標志物共有36個，分別為：鳥氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸、二甲基甘氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甜菜堿、肌酸、L-脯氨酸、甘油酸、4-胍基丁酸、腺嘌呤、尿嘧啶、L-蛋氨酸、尿苷、L-酪氨酸、肌苷、鳥苷、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、脫氧鳥苷、胸腺嘧啶、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、琥珀酸、腺苷、脫氧胞苷、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、腺苷一磷酸、γ-氨基丁酸、脫氧腺苷一磷酸、尿苷5'-一磷酸、D-核糖5-磷酸、鳥苷一磷酸、精氨基琥珀酸；

生物標志物主要指向9條代謝通路，分別為：氨酰基-tRNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、氮代謝、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、嘌呤代謝、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、嘧啶代謝。

2.根據權利要求1所述的一種基于脾臟代謝組學研究硒化氨基多糖對黑鯛免疫機制增強模型的構建方法，其特征在于，步驟1)中黑鯛幼魚處理的具體方法為：將黑鯛幼魚進行停飼處理，隨后放入玻璃纖維缸內微流水式飼養；

步驟2)中實驗組和空白組飼喂具體方法為：將實驗組和空白組采用普通飼料進行飼喂，并在實驗組普通飼料中添加0.5～0.7mg Se/kg的硒化氨基多糖，連續飼喂8-10周；

步驟3)中飼喂結束后黑鯛幼魚處理的具體方法為：將實驗組和空白組的黑鯛幼魚饑餓20-30h后，用麻醉劑麻醉，取出脾臟組織，實驗組和空白組各取數量相同的平行樣，隨后進行稱重，并用液氮快速冷凍，最后放置于-80℃的超低溫冰箱中保存，備用；

步驟4)中所述脾臟組織樣品制備方法為：取備用脾臟組織于離心管，加入-10～-30℃冷凍的5-15倍體積的甲醇，10000-14000rpm下均質0.5-1.5min后，在4℃下超聲2-5min，隨后，在4℃、12000-14000rpm下離心10-20min，取上清液在30-50℃下氮氣吹干，并用甲醇水溶液復溶；質控樣品制備方法為：取上述各個脾臟組織樣品制備中的上清液混合均勻，在30-50℃下氮氣吹干，并用甲醇水溶液復溶；

步驟4)中使用超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術進行處理的具體方法為：將脾臟組織樣品經微孔濾膜過濾之后，在固定的色譜條件和質譜條件下，進入超高效液相色譜-質譜聯用儀分析，其中，在檢測過程中，每隔相同數量的脾臟組織樣品插入一個質控樣品進行檢測分析，以監控檢測穩定性；

步驟5)中黑鯛脾臟代謝組學數據進行分析處理的具體方法為：利用XCMS^plus對采集的黑鯛脾臟代謝組學數據進行全面的非靶向代謝組學分析，采用Centwave特征檢測算法進行峰的發現和匹配，找到有差異的生物標志物，XCMS Plus軟件會自動鏈接到METLIN數據譜庫，并結合內源性代謝物二級譜庫，根據與譜庫中化合物的精確一級m/z、同位素豐度比一級和二級質譜信息，鑒定得出有差異的生物標志物，并把這些生物標志物通過聚類分析，找出代謝通路。