[發明專利]甬優4949種子純度檢測的SSR引物及方法

有效

• 申請號: 201910491102.0
• 申請日: 2019-06-06
• 公開（公告）號: CN110093448B
• 公開（公告）日: 2022-11-04
• 發明（設計）人: 周元坤;李詩成;胡世平
• 申請（專利權）人: 武漢佳禾生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 武漢明正專利代理事務所(普通合伙) 42241
• 代理人: 江灃

1.甬優4949種子純度檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、提取待測甬優4949種子的DNA；

S2、以提取的DNA為模板，使用引物對RM72或引物對RM224進行PCR擴增，得

到擴增產物；

其中，引物對RM72包含：正向引物，其從5’端到3’為：CCGGCGATAAAACAATGAG，反向引物，其從5’端到3’為： GCATCGGTCCTAACTAAGGG ；

引物對RM224包含：正向引物，其從5’端到3’為：ATCGATCGATCTTCACGAGG，反向引物，其5’端到3’為：TGCTATAAAAGGCATTCGGG ；

S3、對S2中得到的擴增產物進行凝膠電泳檢測；

S4、根據電泳分離出來的條帶，只有同時具有親本特異條帶的單株才為真正的甬優

4949種子，其中，引物對RM72產生的母本特異性條帶大小為180bp，產生的父本特異性條帶大小為150bp，引物對RM224產生的母本特異性條帶大小為120bp，產生的父本特異性條帶大小為160bp。

2.如權利要求1所述的甬優4949種子純度檢測方法，其特征在于，S1中提取待測甬優4949種子的DNA具體包括：

A1、將待測種子置于離心管中，加入CTAB提取液，水浴；

A2、然后加入體積比為24:1的氯仿和異戊醇，混勻，離心，得到上清液，然后向上

清液中加入異丙醇，混勻，離心，得到沉淀，洗滌，干燥后使用含有RNA酶的雙蒸水溶解，即得甬優4949種子的DNA。

3.如權利要求2所述的甬優4949種子純度檢測方法，其特征在于，水浴溫度為56℃、時間為20～30 min；加入體積比為24:1的氯仿和異戊醇，混勻，于12000 rpm下離心10min；

向上清液中加入異丙醇，于-20℃下靜置1 h，混勻，于4℃下以12000 rpm離心15 min，得到沉淀；使用體積分數為60~70%乙醇洗滌沉淀。

4.如權利要求1所述的甬優4949種子純度檢測方法，其特征在于，S2中PCR擴增反應體系，包括：1 μL的DNA、2 μL的Buffer緩沖液、1 μL的dNTP、1 μL的10 μM的SSR引物、0.4 Unit的Taq DNA聚合酶；

PCR擴增反應程序：95℃變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸60 s，循環35次；72℃延伸5 min，4℃終止反應。

5.如權利要求2所述的甬優4949種子純度檢測方法，其特征在于，A1中CTAB提取液組成為：每1L提取液中含有15 g的CTAB、75 mL1M的 Tris-HCl、30 mLpH為 8.0的EDTA溶液、161.4 g 的NaCl；所述pH為 8.0的EDTA溶液的制備為：將EDTA溶于雙蒸水中，并用NaOH調節pH至8.0。

6.如權利要求1所述的甬優4949種子純度檢測方法，其特征在于，S3中凝膠電泳檢測具體為：將擴增產物6% 變性聚丙烯酰胺凝膠上于功率為140W下電泳1~1.5h，電泳結束后凝膠用蒸餾水沖洗，用0.2wt%的 AgNO₃溶液染色15min，漂洗 10s，然后含有2wt%的NaOH、0.04wt%的Na₂CO₃、0.4wt% 的甲醛的水溶液，顯影至帶型清晰。