[發明專利]含有玉米抗菌蛋白的微擬球藻及其轉化方法和應用

在審

• 申請號: 201910491079.5
• 申請日: 2019-06-06
• 公開（公告）號: CN110373330A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 王愛華;姜國勇;遲勝起;管明利
• 申請（專利權）人: 青島農業大學;青島市農業行政執法支隊
• 主分類號: C12N1/13
• 分類號: C12N1/13;C12N15/29;C12N15/63;C12N15/66;C12R1/89
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 夏燕

本發明公開了一種含有玉米抗菌蛋白的微擬球藻及其轉化方法和應用，轉化方法包括以下步驟：構建重組質粒、微擬球藻細胞的轉化、重組玉米抗菌蛋白z108β在微擬球藻細胞中的表達及重組玉米抗菌蛋白z108β的提取和純化。該玉米抗菌蛋白在微擬球藻中轉化的技術方法具有易于操作、玉米抗菌蛋白生產成本低、獲得的玉米抗菌蛋白純度高的優點；另外，玉米抗菌蛋白通過微擬球藻在水體中表達其多肽以分泌蛋白的形式釋放到水中，對于凈化水體、消除微生物污染，優化水源起到重要的作用，在水生生物養殖的防病治病、養殖水體的凈化有著潛在的應用價值。

技術領域

本發明涉及基因重組技術領域，具體為一種玉米抗菌蛋白在微擬球藻中轉化的技術方法。

背景技術

玉米抗菌蛋白是一種II型核糖體失活蛋白（RIP），是植物體內一種抑制異源生物體活性的防衛蛋白，其主要功能表現在水解后的蛋白RIP具有兩個肽鏈—α肽和β肽，兩個肽鏈都有活性，其中α肽具有N-糖苷酶活性，而β肽具有類凝聚素的Lectin活性。從玉米胚芽中獲得的z108基因經過重組以后，在大腸桿菌表達的重組蛋白對于黃曲霉（A. flavus）等多種病原菌具有抑制孢子萌發的作用，是一種具有抗菌特點的防衛蛋白；而它的β肽鏈能夠獨立地與細胞表面的糖元或半乳糖結合，抑制甜菜夜蛾（S. exigua）等害蟲的取食，表現出一種抑制鱗翅目昆蟲生長的作用。這種抗菌蛋白來自于植物自身的合成產物，不會對人體產生負面的影響，將其應用到動物、植物的防病治病當中，具有環保和對人體無害的優勢。

微擬球藻（Nannochloropsis oceanica），是海洋微藻大眼藻綱的主要種群，因其富含蛋白質、色素及多不飽和脂肪酸（特別是二十碳五烯酸，EPA）等，并具有生長迅速，繁殖速度快，細胞顆粒小等優點，是一種重要的經濟微藻。由于體積微小，適用于口徑小的魚蝦類，目前主要作為優良的魚蝦餌料或飼料添加劑，同時具有重要的生態學和經濟學價值，也是目前公認的最有希望用于工業化的高產油海水藻。

在過去的研究中，已經將玉米的核糖體失活蛋白基因z108轉移到大腸桿菌BL21中，在實驗室條件下提取、純化并獲得重組的抗菌蛋白。例如2010年獲得了一項發明專利（一種玉米抗菌蛋白的基因及其編碼蛋白的應用ZL200810014139.6）。

發明內容

鑒于此，本發明提供了一種玉米抗菌蛋白z108β多肽在微擬球藻中轉化的技術方法，具體涉及通過基因轉化的方法將玉米抗菌蛋白的基因z108β轉入微擬球藻中使其表達，并進行細胞培養，利用微擬球藻作為生物反應器來生產重組玉米抗菌蛋白z108β，獲得可以生產重組玉米抗菌蛋白z108β的微擬球藻，并提取玉米抗菌蛋白z108β。該玉米抗菌蛋白在微擬球藻中轉化的技術方法具有易于操作、玉米抗菌蛋白生產成本低、獲得的玉米抗菌蛋白純度高的優點。

本發明的技術方案如下：

一種玉米抗菌蛋白在微擬球藻中轉化的技術方法，具體步驟如下：

（1）構建重組質粒

載體質粒pBA002用雙酶切，與經雙酶切后的玉米蛋白中的z108基因連接，獲得連接產物，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5a中，獲得重組質粒載體pBA002-z108β及其菌株pBA7786，將菌株于-70℃保存；

（2）微擬球藻細胞的轉化

S1，用試劑盒提取重組質粒載體pBA002-z108β的DNA，用于基因槍法基因轉化；