[發明專利]含有玉米抗菌蛋白的微擬球藻及其轉化方法和應用

在審

• 申請號: 201910491079.5
• 申請日: 2019-06-06
• 公開（公告）號: CN110373330A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 王愛華;姜國勇;遲勝起;管明利
• 申請（專利權）人: 青島農業大學;青島市農業行政執法支隊
• 主分類號: C12N1/13
• 分類號: C12N1/13;C12N15/29;C12N15/63;C12N15/66;C12R1/89
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 夏燕

1.含有玉米抗菌蛋白z108β基因的微擬球藻。

2.玉米抗菌蛋白在微擬球藻中轉化的方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）構建重組質粒

載體質粒pBA002用雙酶切，與經雙酶切后的玉米蛋白中的z108β基因連接，獲得連接產物，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5a中，獲得重組質粒載體pBA002-z108β及其菌株pBA7786，將菌株于-70℃保存；

（2）微擬球藻細胞的轉化

S1，用試劑盒提取重組質粒載體pBA002-z108β的DNA，用于基因槍法基因轉化；

S2，將微擬球藻置入直徑為60mm的無菌培養皿內，調節微擬球藻的細胞密度為1×10⁶-8×10⁶個/mL，備用；

S3，當阻擋網與材料間距3-9cm時，對上述已調節細胞密度的微擬球藻細胞團進行轟擊，轟擊壓力為1100 psi；

S4，轟擊后的微擬球藻細胞加入F/2培養液，在23-25℃條件下遮光恢復培養48小時，獲得培養液Ⅰ；

S5，向培養液Ⅰ中加入濃度為10-40mg/L的草丁膦溶液，培養14天，獲得培養液Ⅱ；

（3）重組玉米抗菌蛋白z108β在微擬球藻細胞中的表達

S1，將培養液Ⅱ均勻涂布在帶有濾紙的培養皿中，挑取綠色的微擬球藻轉化體細胞，加入培養液單獨培養，獲得培養液；

S2，對培養液中的微擬球藻轉化體細胞進行PCR、RT-PCR檢測，并進行玉米抗菌蛋白表達檢測；

（4）重組玉米抗菌蛋白z108β的提取和純化

S1，微擬球藻轉化體細胞內重組玉米抗菌蛋白的提取

取0.1g微擬球藻轉化體放入液氮中研磨，加入1×樣品緩沖液200μL，混合后煮沸5min，12000rpm離心10min；棄掉沉淀，保留上清液；

S2，利用SDS-PAGE電泳鑒定

取20μL上清液，用于點樣檢驗；電泳條件為：80V電壓電泳30分鐘后，電壓120V電泳60-80分鐘；用考馬斯亮藍染色，脫色后觀察；

S3，重組蛋白的濃縮和保藏

將離心純化的蛋白集中收集，離心純化后的重組玉米抗菌蛋白z108β在-20℃條件下保存。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（1）中，載體質粒pBA002用XbaI/SacI雙酶切，與pUCm-T-1192中的插入序列z108β基因連接，其連接產物轉化到大腸桿菌DH5a中，獲得重組質粒載體pBA002-z108β及其菌株pBA7786，-70℃保存。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（2）的S1中，調節微擬球藻的細胞密度為5×10⁶個/mL，轉化時，用直徑60mm的無菌培養皿，將細胞均勻平鋪濾紙片中部，形成直徑2cm左右的圓形轟擊圈。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（2）的S3中，采用PDS-1000\He型基因槍進行基因轉化；阻擋網與材料間距為3cm。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（2）的S4中，轟擊后的微擬球藻細胞加入F/2培養液，培養溫度是25℃，遮光恢復培養48小時。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（2）的S5中，培養條件：溫度：23-25℃；光照培養14小時、暗培養10小時，光照為2500-3500Lux；草丁膦篩選濃度為20mg/L。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（3）的S1中，所述培養液為F/2培養液，每5天更換一次營養液；培養條件：溫度23-25℃；光照培養14小時、暗培養10小時，其中，光照為2500-3500Lux。