[發明專利]一種基于熔解曲線分析的GSTM1基因缺失檢測方法

在審

• 申請號: 201910485738.4
• 申請日: 2019-06-05
• 公開（公告）號: CN110184333A
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 黃拔嚴;張彥偉
• 申請（專利權）人: 北京益序醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京智行陽光知識產權代理事務所(普通合伙) 11738
• 代理人: 黃錦陽

本發明公開了一種基于熔解曲線分析的GSTM1基因缺失檢測方法，包括步驟一，模板的制備；步驟二，引物的合成與準備；步驟三，結果的判定；模板的制備包括以下步驟：用清水漱口后，采集口腔脫落細胞，采集時將口腔脫落細胞采集拭子伸進口腔壁，緊靠臉頰內側上下刮拭30～40次；用1mL TE將細胞涮洗下來，進行離心分層；棄上清，沉淀用50μL TE重懸，即可作為模板；準備PCR引物序列：設定PCR體系和PCR程序根據熔解曲線的峰型判定基因型；該基于熔解曲線分析的GSTM1基因缺失檢測方法，采用單步分析方法，細胞采集后直接進行分析，無需核酸提取，步驟簡單，且對照與目標基因的分析單管內就可以實現，減少實驗步驟及成本，且熒光通道只要一個，對設備要求低。

技術領域

本發明涉及基因缺失檢測方法技術領域，具體為一種基于熔解曲線分析的GSTM1基因缺失檢測方法。

背景技術

谷胱甘肽轉移酶(GSTs)是一種重要的酶家族，它催化多種外源性物質的解毒，包括環境致癌物、化療藥物和活性氧。它們參與第二階段的解毒，介導還原型谷胱甘肽與親電化合物的偶聯，從而消除有毒化合物。因此，GSTs在保護細胞免受環境暴露和氧化應激中發揮重要作用，并與細胞對藥物的耐藥性有關。

GSTM1是GSTs家族中重要的一員，它有一個常見的多態性的特點是完全缺失基因。2個純合缺失(無基因型)導致酶及其催化活性的缺失，這已被證明會降低細胞對某些毒性物質的解毒能力。GSTM1的缺失基因型，被認為是一些與外源性物質相關疾病易感性的關鍵因素，如肺癌、鼻咽癌等。此外，GSTM1的缺失基因型也被認為與鉑類、奈韋拉平、氯氮平等藥物的療效及副作用有關。

目前應用最廣泛的基因缺失分型方法是傳統的多重PCR加凝膠電泳分析、taqman探針法和芯片法。傳統的多重PCR加凝膠電泳分析，步驟繁瑣，不適用中高通量的樣本分析。Taqman探針法往往需要兩個熒光通道以上的實時PCR儀，對儀器要求較高，且探針合成較貴。芯片法需要專門的儀器與耗材，步驟繁瑣，價格昂貴，對少數幾個基因的分型并不合適。因此設計一種基于熔解曲線分析的GSTM1基因缺失檢測方法是十分有必要的。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于熔解曲線分析的GSTM1基因缺失檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為了解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案：一種基于熔解曲線分析的GSTM1基因缺失檢測方法，包括步驟一，模板的制備；步驟二，引物的合成與準備；步驟三，結果的判定；

其中在上述步驟一中，模板的制備包括以下步驟：

1)用清水漱口后，采集口腔脫落細胞；

2)用1mL TE將細胞涮洗下來，進行離心分層；

3)棄上清，沉淀用50μL TE重懸，即可作為模板；

其中在上述步驟二中，引物的合成與準備包括以下步驟：

1)PCR引物序列：

①GSTM1-F GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC；

②GSTM1-R GTTGGGCTCAAATATACGGTGG；

③BCL2-F GCAATTCCGCATTTAATTCATGG；

④BCL2-R GAAACAGGCCACGTAAAGCAAC；

2)PCR體系：

①5ul的Talent qPCR Premix反應液2個；

②2ul的引物混合液；

③1ul的模板；

④2ul的水；

3)PCR程序：