[發明專利]三基因報告系統及其建立方法和應用

有效

• 申請號: 201910484405.X
• 申請日: 2019-06-05
• 公開（公告）號: CN110305897B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 谷峰;楊發譽
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心上海分中心）
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/65;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 上海序倫律師事務所 31276
• 代理人: 周東萍

本發明公開一種快速測定基因組編輯活性的三基因報告系統，該報告系統包括三基因報告細胞系和基因編輯系統活性的快速檢測體系。所述三基因報告細胞系為在HEK?293細胞AAVS1位點整合有TK?Neo?T2A?GFP?Ires?Puro基因的單克隆HEK?293?AAVS?TK?Neo?T2A?GFP細胞系，TK?Neo?T2A?GFP基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因編輯系統活性的快速檢測體系為針對三報告基因TK、Neo和GFP基因分別設計單鏈引導RNA，構建質粒后轉染報告細胞系。利用本發明的三基因報告系統可以在體外快速、有效、高通量的對基因組編輯工具的活性進行檢測，有助于基因編輯系統的快速篩選和優化，為基因編輯工具的研發提供一個高效的篩選平臺。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種快速測定基因組編輯活性的三基因報告系統及其建立方法和應用。

背景技術

基因組編輯技術是利用核酸酶對基因組進行精確地定點修飾，包括對基因組進行靶向基因敲入(Knock-in)、基因敲除(Knock-out)以及基因替換(Replacement)。CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas系統的發現和應用為生物學的基礎理論研究和轉化應用提供了簡單而強大的基因組編輯平臺，因此迅速成為遺傳操作的主流工具，并已成功應用于微生物、植物和動物等生物基因組編輯。由于CRISPR-Cas系統數量龐大，單一的標準難以將其歸類。研究者根據Cas基因的組成和干擾靶基因的效應蛋白的數量，將CRISPR-Cas系統分為2大類，共5種型16個亞型。第一大類包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型，它們切割外源核酸需要多個Cas蛋白共同發揮作用；第二大類包括Ⅱ型和Ⅴ型，它們切割外源核酸只需要單一的效應蛋白，如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf1蛋白。隨后，研究者又發現了Ⅵ型新系統，對原有的分類進行了補充。2018年，Ⅵ型系統中的新成員——Cas13d(VI-D)被發現。至此CRISPR-Cas系統又可分為2大類，共6種型23個亞型。面對如此多已知和未知種類的CRISPR-Cas系統，如何在體外有效、快速、高通量篩選出候選有活性的基因編輯工具是領域內一直關注的問題。而建立高效的報告系統則有助于基因編輯系統的快速篩選和優化，能為基因編輯工具的研發提供一個有效的篩選平臺。

發明內容

本發明要解決目前不能在體外有效、快速、高通量篩選出候選基因編輯工具活性的技術問題，提供一種快速測定基因組編輯活性的三基因報告系統，該三基因報告系統有助于基因編輯系統的快速篩選和優化，為基因編輯工具的研發提供一個有效的篩選平臺。

為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現:

在本發明的一個方面，提供了一種pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro重組載體，所述重組載體包含tk基因、neo基因、T2A序列、GFP基因，IRES基因和嘌呤霉素抗性基因puro，其中，TK-Neo-T2A-GFP基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

所述pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro重組載體構建方法的步驟如下：

1)人工合成T2A基因序列；

2)用PCR和OE-PCR擴增TK-Neo和T2A-GFP-Ires-Puro基因序列，利用In-Fusion克隆到pDonor-mT/mG載體上，得到重組pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro載體。pDonor-mT/mG載體的制備方法見http://www.addgene.org/17787，為已知技術。

本發明還提供了一種CRISPR/Cas9-AAVS1載體，所述載體是在pX330載體上插入針對哺乳動物細胞AAVS1位點的sgRNA序列，sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示。