[發(fā)明專利]三基因報告系統(tǒng)及其建立方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910484405.X
• 申請日: 2019-06-05
• 公開（公告）號: CN110305897B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 谷峰;楊發(fā)譽
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心上海分中心）
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/65;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 上海序倫律師事務(wù)所 31276
• 代理人: 周東萍

1.一種pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro重組載體，包含tk基因、neo基因、T2A序列、GFP基因，IRES基因和嘌呤霉素抗性基因puro，其中，TK-Neo-T2A-GFP基因的序列如SEQ IDNO.1所示。

2.權(quán)利要求1所述重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法的步驟如下：

1)人工合成T2A基因序列；

2)用PCR和OE-PCR擴增TK-Neo和T2A-GFP-Ires-Puro基因序列，利用In-Fusion克隆到pDonor-mT/mG載體上，得到重組pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro載體。

3.一種CRISPR/SaCas9載體，其為pX601載體上插入針對權(quán)利要求1所述TK-Neo-T2A-GFP基因中TK、Neo和GFP三個報告基因位點分別設(shè)計的sgRNA序列，所述sgRNA序列如SEQ IDNO.3-5所示。

4.一種三基因報告細胞系，所述細胞系基因組上AAVS1位點整合有TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro基因，其中，TK-Neo-T2A-GFP基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

5.權(quán)利要求4所述細胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟如下：

1)HEK-293細胞計數(shù)后接種于6孔板；

2)使用細胞轉(zhuǎn)染試劑將權(quán)利要求1所述重組載體和CRISPR/Cas9-AAVS1載體共轉(zhuǎn)入HEK-293細胞，所述CRISPR/Cas9-AAVS1載體為pX330載體上插入針對哺乳動物細胞AAVS1位點的sgRNA序列，該sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示；

3)HEK-293轉(zhuǎn)染后換液、傳代，用抗生素嘌呤霉素Puromycin篩選；

4)若干天后，在顯微鏡下挑選單克隆細胞，獲得整合有TK-Neo和T2A-GFP-Ires-Puro基因的單克隆HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP細胞系，即為三基因報告細胞系。

6.一種快速測定基因組編輯活性的三基因報告系統(tǒng)，所述報告系統(tǒng)包括權(quán)利要求4所述的細胞系和基因編輯系統(tǒng)活性的快速檢測體系，所述基因編輯系統(tǒng)活性的快速檢測體系為CRISPR/SaCas9基因編輯系統(tǒng)。

7.一種快速測定基因組編輯活性的三基因報告系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，包括權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法和基因編輯系統(tǒng)活性的快速檢測體系構(gòu)建方法，其中，基因編輯系統(tǒng)活性的快速檢測體系構(gòu)建方法是針對三報告基因胸苷激酶基因TK、新霉素基因Neo和綠色熒光蛋白基因GFP分別設(shè)計sgRNA，構(gòu)建質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染權(quán)利要求4所述三基因報告細胞系。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的三基因報告系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，所述基因編輯系統(tǒng)活性的快速檢測體系構(gòu)建方法包括如下步驟：

1)構(gòu)建針對TK-Neo-T2A-GFP序列的CRISPR/SaCas9載體，在pX601載體上插入針對TK-Neo-T2A-GFP不同位點的sgRNA序列，sgRNA序列如SEQ ID NO.3-5；

2)權(quán)利要求5所述HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP細胞計數(shù)后接種于24孔板；

3)將pX601-sgRNA載體轉(zhuǎn)入HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP細胞中，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光情況；

4)收集細胞，流式細胞術(shù)檢測綠色熒光細胞的比率，以評估CRISPR/SaCas9基因編輯的效率。