[發(fā)明專利]一種同時定點整合FAD3和FABP4基因的載體及重組細胞

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• 申請日: 2019-06-04
• 公開（公告）號: CN110283847A
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發(fā)明（設計）人: 權(quán)富生;董翔宸;張涌;葛陸星;康健;劉旭;謝曉剛
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/113;C12N5/10;C12N15/877
• 代理公司: 北京慕達星云知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發(fā)明公開了一種同時定點整合FAD3和FABP4基因的載體及重組細胞，利用電穿孔的方法將靶向Rosa26基因的Cas9切割載體和打靶載體共轉(zhuǎn)染魯西黃牛胎兒成纖維細胞，實現(xiàn)將FAD3和FABP4基因同時定點插入到魯西黃牛胎兒成纖維細胞基因組中；通過Junction PCR篩選和驗證獲得了打靶陽性克隆細胞；以本發(fā)明定點插入外源基因的陽性細胞為供核細胞移入去核的牛成熟卵母細胞中，獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，進一步將克隆胚胎移植到受體牛體內(nèi)，可獲得所期望的轉(zhuǎn)基因牛。本發(fā)明為快速、高效研制優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因肉牛育種新材料提供了供核細胞和技術方法。

技術領域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因克隆動物技術領域，更具體的說是涉及一種基于CRISPR/Cas9介導的同時定點整合FAD3基因和FABP4基因的載體及重組細胞。

背景技術

脂肪酸脫氫酶(Fatty Acid Desaturase，F(xiàn)AD)是催化飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸鏈上特定的位置形成雙鍵的酶類，它是多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)合成途徑的關鍵酶。其中FAD3基因是植物中的一種多不飽和脂肪酸去飽和酶基因，屬于ω-3型多不飽和脂肪酸脫氫酶，該酶以ω-6多不飽和脂肪酸為優(yōu)先底物，使其脫氧轉(zhuǎn)化為ω-3多不飽和脂肪酸。ω-3多不飽和脂肪酸是組成人體必需的物質(zhì)，對健康非常重要，ω-6與ω-3PUFA比值過高可導致心血管疾病、癌癥、炎癥以及自身免疫反應等疾病，并且對于新生兒及幼兒的大腦、中樞神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育起重要作用。總之，F(xiàn)AD3基因是一種能有效將自身ω-6PUFAs轉(zhuǎn)化為ω-3PUFAs的多不飽和脂肪酸去飽和酶基因，其可以作為改善脂肪酸比例的理想酶基因。

脂肪酸結(jié)合蛋白4(adipose fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP4)，又可稱為A-FABP，是組織特異性脂肪酸結(jié)合蛋白家族FABPs(fatty acid binding proteins)的重要成員之一，參與脂類代謝和脂肪沉積的調(diào)控，并在長鏈脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運以及能量代謝和炎癥反應中起著重要的調(diào)控作用。其占細胞總蛋白量約為6％，主要在脂肪組織中表達量較高，因此是成熟脂肪細胞中重要的胞質(zhì)蛋白之一。已有研究表明，F(xiàn)ABP4與脂質(zhì)代謝紊亂、糖尿病和肥胖相關。在脂肪細胞分化過程中，F(xiàn)ABP4 mRNA表達水平顯著升高，并且會受到脂肪酸、PPARγ激動劑及胰島素的調(diào)控。在脂肪酸沉積和降解過程中，F(xiàn)ABP4表達水平的提高可促進脂肪的沉積和脂解效率降低。FABP4作為一種脂質(zhì)蛋白伴侶，對長鏈脂肪酸具有高親和力，說明FABP4可優(yōu)先結(jié)合長鏈脂肪酸，促進長鏈脂肪酸的吸收和降解。因此，F(xiàn)ABP4影響脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運、酯化和β-氧化，調(diào)節(jié)體內(nèi)能量平衡和脂質(zhì)信號轉(zhuǎn)導，也是影響牛肉嫩度和增加肌內(nèi)脂肪含量的候選基因。

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/CRISPR-associated nuclease 9)系統(tǒng)是一種后天免疫防御系統(tǒng)，用以保護細菌或古細菌免受外來質(zhì)粒或噬菌體的侵入。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以實現(xiàn)DNA片段的刪除、反轉(zhuǎn)、重復、插入和易位等基因編輯，也可用于功能基因篩選、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控和標記成像等科研領域。其基因編輯的大致原理為：首先，sgRNA引導Cas9蛋白靶向DNA序列，對其進行識別并且切割，從而形成DNA雙鏈斷裂切口(double-strand break，DSB)；然后，細胞的自我修復過程啟動，即通過非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重組(homology-directed repair，HDR)兩種途徑，對DSB進行修復。由于NHEJ修復會造成開放閱讀框的位點缺失或插入，從而導致移碼突變，完成對生物體DNA序列進行刪除、添加、替換的編輯工作，效率較高；HDR修復過程需要同源模板用來重組斷裂的DNA序列，達到條件性基因敲除、敲進、替換、點突變等工作，效率低但保真性高。