[發明專利]一種同時定點整合FAD3和FABP4基因的載體及重組細胞

在審

• 申請號: 201910482661.5
• 申請日: 2019-06-04
• 公開（公告）號: CN110283847A
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發明（設計）人: 權富生;董翔宸;張涌;葛陸星;康健;劉旭;謝曉剛
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/113;C12N5/10;C12N15/877
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

1.一種基于CRISPR/Cas9介導的同時定點整合FAD3基因和FABP4基因的載體，其特征在于，包括Cas9切割載體和打靶載體；

所述Cas9切割載體包括Cas9蛋白表達框和sgRNA表達框，sgRNA靶點在牛基因組22號染色體Rosa26基因上；

所述打靶載體包括用于同源重組的重組基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA，以及作為同源左臂的sgRNA靶點上游序列和同源右臂的sgRNA靶點的下游序列；所述重組基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA依次包括牛骨骼肌特異性啟動子MRF、由P2A相連的FAD3基因CDS區和FABP4基因CDS區以及PolyA。

2.根據權利要求1所述的一種基于CRISPR/Cas9介導的同時定點整合FAD3和FABP4基因的載體，其特征在于，所述Cas9切割載體為pSpCas9-sgRNA，通過在pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)載體上連接sgRNA靶點序列構建而成。

3.根據權利要求2所述的一種基于CRISPR/Cas9介導的同時定點整合FAD3和FABP4基因的載體，其特征在于，所述sgRNA靶點的核苷酸序列如下：

pSpCas9-Sg21 F：5’-CACCGTACCTGTTACATACAGTACC-3’；SEQ ID NO.13；

pSpCas9-Sg21 R：5’-AAACGGTACTGTATGTAACAGGTAC-3’；SEQ ID NO.14。

4.根據權利要求1所述的一種基于CRISPR/Cas9介導的同時定點整合FAD3和FABP4基因的載體，其特征在于，所述重組基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA中，MRF的核苷酸序列如SEQID NO.35所示，FAD3基因CDS區的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，FABP4基因CDS區的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示，PloyA的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。

5.根據權利要求1所述的一種基于CRISPR/Cas9介導的同時定點整合FAD3和FABP4基因的載體，其特征在于，所述打靶載體同源臂包括分別位于重組基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA上游、下游的5’同源臂和3’同源臂，所述重組基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA與3’同源臂之間還設有一對同向的Loxp，該對Loxp之間設有篩選基因表達框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA。

6.根據權利要求5所述的一種基于CRISPR/Cas9介導的同時定點整合FAD3和FABP4基因的載體，其特征在于，所述5’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。

7.根據權利要求1所述的一種基于CRISPR/Cas9介導的同時定點整合FAD3和FABP4基因的載體，其特征在于，所述打靶載體是通過依次將sgRNA靶點上游5’同源臂、重組基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA、篩選基因表達框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA以及sgRNA靶點下游3’同源臂插入到打靶骨架載體T-VectorpMD19構建而成的。

8.一種基于CRISPR/Cas9介導的同時定點整合FAD3和FABP4基因的重組細胞，其特征在于，通過Cas9切割載體和打靶載體共同轉染宿主細胞，將目的基因FAD3和FABP4定點插入到宿主細胞的22號染色體Rosa26基因中。

9.根據權利要求8所述的一種基于CRISPR/Cas9介導的同時定點整合FAD3和FABP4基因的重組細胞，其特征在于，所述宿主細胞為魯西黃牛胎兒成纖維細胞。

10.一種基于CRISPR/Cas9介導的同時定點整合FAD3和FABP4基因的重組細胞作為核移植構建轉基因克隆胚的核供體細胞的應用。