[發(fā)明專利]一種基于RPA快速檢測(cè)水稻惡苗病菌藤倉(cāng)鐮孢的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910479869.1
• 申請(qǐng)日: 2019-06-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110117592A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范在豐;馬文娣;田逸英;焦志遠(yuǎn);任彬元;楊普云;倪運(yùn)東;李愛(ài)國(guó)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 秦夢(mèng)楠

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于RPA快速檢測(cè)水稻惡苗病菌藤倉(cāng)鐮孢的方法。本發(fā)明提供的引物對(duì)由序列表的序列1和序列2所示的兩條引物組成。本發(fā)明還建立了水稻惡苗病菌藤倉(cāng)鐮孢的快速檢測(cè)方法。本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的引物可以有效擴(kuò)增靶基因，特異性和靈敏性更高，可用于由水稻惡苗病菌藤倉(cāng)鐮孢的快速檢測(cè)，精準(zhǔn)防控該病害的發(fā)生與流行。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于RPA快速檢測(cè)水稻惡苗病菌藤倉(cāng)鐮孢的方法。

背景技術(shù)

水稻惡苗病(rice bakanae disease)是嚴(yán)重影響水稻生長(zhǎng)發(fā)育的真菌病害之一，通過(guò)帶菌種子進(jìn)行傳播，病稻草也是其主要初侵染源。在我國(guó)分布廣泛，其發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可致使水稻減產(chǎn)50％以上。其發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為葉鞘葉片狹長(zhǎng)，葉色呈現(xiàn)淡黃色，發(fā)病植株徒長(zhǎng)，相較健康植株細(xì)高，而根系發(fā)育不良，根長(zhǎng)變短且有倒生根，根毛少。水稻種子萌發(fā)后，病菌從芽鞘、根與根冠等部位侵染秧苗致病。病株上產(chǎn)生的惡苗病菌的分生孢子可從傷口侵入秧苗，引起發(fā)病。水稻開(kāi)花時(shí)，病菌的分生孢子傳染到健康的小穗上，最終形成帶菌種子。在機(jī)械脫粒時(shí)，病種子的分生孢子會(huì)污染其他無(wú)病種子，致使其帶菌，再次引起病菌的擴(kuò)散。因而，水稻的全生長(zhǎng)季都可能感染惡苗病菌，引起發(fā)病。

近年來(lái)，水稻惡苗病在我國(guó)的發(fā)病率逐漸上升，發(fā)病面積愈來(lái)愈大，嚴(yán)重影響我國(guó)水稻生產(chǎn)。水稻惡苗病菌的有性態(tài)為藤倉(cāng)赤霉復(fù)合種(Gibberella fujikuroi speciescomplex,GFC)。目前研究表明，水稻惡苗病主要由層出鐮孢(F.proliferatum)、擬輪枝鐮孢(F.verticillioides)、藤倉(cāng)鐮孢(F.fujikuroi)和F.andiyazi導(dǎo)致的。其中層出鐮孢、擬輪枝鐮孢、藤倉(cāng)鐮孢為藤倉(cāng)赤霉的復(fù)合種(GFC)。GFC復(fù)合種至少由10個(gè)不同交配群(A-J)組成，擬輪枝鐮孢屬于交配群A，藤倉(cāng)鐮孢屬于交配群C，層出鐮孢屬于交配群D。GFC復(fù)合種種內(nèi)成員形態(tài)特征非常相似，難以區(qū)分，藤倉(cāng)鐮孢與層出鐮孢的一些基因序列也非常相似。藤倉(cāng)鐮孢是水稻惡苗病的主要病原菌，致病力最強(qiáng)，分布最廣。

目前應(yīng)用的水稻惡苗病病原菌的檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的鑒定方法和基于PCR的分子生物學(xué)技術(shù)。但這些技術(shù)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度偏低，檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)，或依賴于精密的儀器設(shè)備等。因此，建立便捷、特異、高效的水稻惡苗病菌藤倉(cāng)鐮孢的檢測(cè)方法迫在眉睫。

重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技術(shù)是高效、特異的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)由多種酶和蛋白參與，僅需設(shè)計(jì)2條特異性引物，在20分鐘內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)核酸指數(shù)擴(kuò)增的新技術(shù)，具有反應(yīng)靈敏、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。RPA技術(shù)自開(kāi)發(fā)以來(lái)，已被應(yīng)用于生命科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的病害鑒定與檢測(cè)也提供了更高效的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于RPA快速檢測(cè)水稻惡苗病菌藤倉(cāng)鐮孢的方法。

本發(fā)明首先保護(hù)引物對(duì)，由引物F和引物R組成；

所述引物F為如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(a2)將序列1經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R為如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(a4)將序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子。

所述引物F根據(jù)編碼鏈設(shè)計(jì)；所述引物R根據(jù)互補(bǔ)鏈設(shè)計(jì)。

所述引物對(duì)的用途為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):

(b1)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病菌是否為藤倉(cāng)鐮孢；