[發明專利]牛白細胞介素-2重組乳酸菌及其應用

在審

• 申請號: 201910476723.1
• 申請日: 2019-06-03
• 公開（公告）號: CN110408579A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 張建濤;張娜;李月;遲新宇;劉濤;高利
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/66;A23K10/18;A23K50/10;C12R1/01
• 代理公司: 北京君泊知識產權代理有限公司 11496
• 代理人: 王程遠

本發明屬于生物技術領域，具體涉及牛白細胞介素?2重組乳酸菌及其應用。BoIL?2基因與載體pNZ8148連接，構建pNZ8148?BoIL?2表達載體，將pNZ8148?BoIL?2表達載體轉化到大腸桿菌MC1061感受態細胞，進行質粒的克隆擴增，利用電轉化的方法將質粒pNZ8148?BoIL?2轉化到乳酸乳球菌NZ9000中，并誘導其表達。本申請所述的重組乳酸菌L.lactis NZ9000/pNZ8148?BoIL?2能夠表達有生物活性的牛IL?2，可以穩定傳代20代，能夠提高動物機體免疫功能，增強動物機體抵抗力，減少疾病的發生。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及牛白細胞介素-2重組乳酸菌及其應用。

背景技術

目前在奶牛的養殖過程中許多疾病的預防與治療仍舊依賴于抗生素，但由于抗生素的大量濫用，導致耐藥菌株逐漸增多，細菌產生了高度的耐受能力，嚴重影響了奶牛養殖業和人類的健康安全。白細胞介素-2(IL-2)是由多種細胞產生的一類具有多種作用的細胞因子，具有提高動物機體免疫應答水平、增強動物機體抗病能力的作用。乳酸菌是一種食品級微生物，具有經濟成本低、安全無害等優點，是一類良好的外源蛋白表達載體宿主，同時也是制成轉基因微生態制劑的優秀宿主菌株，目前已有研究將兩者結合，制成轉基因微生態制劑，發揮二者的作用，但牛源細胞因子與乳酸菌二者結合制成轉基因微生態制劑的報道甚少。因此，本研究的目的是利用基因工程方法將牛源IL-2基因轉入到乳酸菌中，制成轉基因微生態制劑，并對其效果進行初步探究，為開發提高奶牛固有免疫力、預防和治療奶牛疾病的轉基因微生態制劑提供基礎，保障奶牛生產安全和動物性食品安全。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了牛白細胞介素-2重組乳酸菌及其應用。

具體技術方案為：牛白細胞介素-2重組乳酸菌，它是轉化了質粒 pNZ8148-BoIL-2到乳酸乳球菌NZ9000的乳酸菌，其中BoIL-2為牛白細胞介素 -2基因的簡稱。

優選的，所述BoIL-2的堿基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

優選的，密碼子優化后BoIL-2的堿基序列如序列表SEQ ID No.2所示。

優選的，所述質粒pNZ8148-BoIL-2是載體pNZ8148中插入了如序列SEQ ID No.2所述的基因。

牛白細胞介素-2重組乳酸菌的制備方法，它包括：

1)、目的基因的合成

BoIL-2基因全長共468bp，利用HindⅢ和EcoRⅠ合成480bp BoIL-2基因；

2)、表達質粒pNZ8148-BoIL-2的構建

2.1目的基因BoIL-2與表達載體的酶切與純化回收

將質粒pUC57-BoIL-2與載體pNZ8148分別用HindIII與KpnI進行雙酶切，酶切時間為6h，完成后取3μL與少量l0×Loading Buffer混勻，跑0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將鑒定正確的酶切產物純化回收；

2.2目的基因與表達載體的連接

將2.1得到的載體pNZ8148使用T4DNA ligase 16℃與目的基因BoIL-2連接過夜；

2.3連接產物轉化到大腸桿菌MC1061F-感受態細胞中；

2.4大腸桿菌MC1061中重組質粒鑒定：

在平板中挑取單個菌落，37℃搖床過夜活化后提取質粒，進行PCR鑒定和雙酶切鑒定；

PCR反應體系如下：