[發明專利]牛白細胞介素-2重組乳酸菌及其應用

在審

• 申請號: 201910476723.1
• 申請日: 2019-06-03
• 公開（公告）號: CN110408579A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 張建濤;張娜;李月;遲新宇;劉濤;高利
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/66;A23K10/18;A23K50/10;C12R1/01
• 代理公司: 北京君泊知識產權代理有限公司 11496
• 代理人: 王程遠

1.牛白細胞介素-2重組乳酸菌，其特征在于，它是轉化了質粒pNZ8148-BoIL-2到乳酸乳球菌NZ9000的乳酸菌，其中BoIL-2為牛白細胞介素-2基因的簡稱。

2.根據權利要求1所述的牛白細胞介素-2重組乳酸菌，其特征在于，所述BoIL-2的堿基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

3.根據權利要求2所述的牛白細胞介素-2重組乳酸菌，其特征在于，密碼子優化后BoIL-2的堿基序列如序列表SEQ ID No.2所示。

4.根據權利要求1所述的牛白細胞介素-2重組乳酸菌，其特征在于，所述質粒pNZ8148-BoIL-2是載體pNZ8148中插入了如序列SEQ ID No.2所述的基因。

5.基于權利要求1-4任一所述牛白細胞介素-2重組乳酸菌的制備方法，其特征在于，它包括：

1)、目的基因的合成

BoIL-2基因全長共468bp，利用HindⅢ和EcoR Ⅰ合成480bp BoIL-2基因；

2)、表達質粒pNZ8148-BoIL-2的構建

2.1目的基因BoIL-2與表達載體的酶切與純化回收

將質粒pUC57-BoIL-2與載體pNZ8148分別用HindIII與KpnI進行雙酶切，酶切時間為6h，完成后取3μL與少量l0×Loading Buffer混勻，跑0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將鑒定正確的酶切產物純化回收；

2.2目的基因與表達載體的連接

將2.1得到的載體pNZ8148使用T4 DNA ligase16℃與目的基因BoIL-2連接過夜；

2.3連接產物轉化到大腸桿菌MC1061F-感受態細胞中；

2.4大腸桿菌MC1061中重組質粒鑒定：

在平板中挑取單個菌落，37℃搖床過夜活化后提取質粒，進行PCR鑒定和雙酶切鑒定；

PCR反應體系如下：

試劑：Premix Taq DNA聚合酶為50μL；引物P_上為2μL；引物P_下為2μL；模板為2μL；ddH2O為44μL；體系為100μL；

反應條件為：94℃30sec；60℃30sec；循環30次，72℃延展1min，反應完成后取3μL產物進行1％凝膠電泳鑒定，觀察結果；

使用內切酶KpnI和HindIII對疑為陽性的重組質粒進行雙酶切鑒定；于37℃恒溫水浴鍋中酶切3h，取3μL進行1％凝膠電泳；

雙酶切反應體系如下：

試劑：重組質粒為8μL；HindIII為2μL；KpnI為2μL；10×M緩沖液為2μL；ddH2O為6μL；體系為20μL；

2.5重組表達質粒的的序列測定

鑒定正確的質粒進行測序，對于測序比對結果正確的陽性質粒命名成pNZ8148-BoIL-2；

3)重組乳酸菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2的構建

3.1重組質粒pNZ8148-BoIL-2的提取

3.2質粒pNZ8148-BoIL-2電轉化至L.lactis NZ9000。

6.根據權利要求5所述的的牛白細胞介素-2重組乳酸菌的制備方法，其特征在于，所述2.3連接產物轉化到大腸桿菌MC1061F-感受態細胞中具體為：

2.3.1將MC1061F-感受態細胞從-80℃冰箱中拿出，放入到冰水混合物中緩慢融化，待MC1061F-感受態細胞融化后將連接產物10μL加入到其中，用手輕輕撥動EP管底，待混勻后在冰水混合物中靜置25min；

2.3.2將EP管迅速插入42℃水浴中，熱激45秒，迅速取出放回冰水混合物中靜置5min，動作盡量小心，不要晃動；

2.3.3向EP管中加入700μL無抗性無菌LB培養基，輕輕混勻，37℃，500rpm水平搖床中復蘇30min；

2.3.4低溫離心機中5000rpm，1min離心，收集菌體沉淀，留取100μL左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含有氯霉素的LB培養基上；

2.3.5將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養。