[發明專利]一種快速檢測IBV二溫式納米PCR試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201910476504.3
• 申請日: 2019-06-03
• 公開（公告）號: CN110066890A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發明（設計）人: 磨美蘭;張文;韋蘭萍;陳基明;范文勝;韋平
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 成都四合天行知識產權代理有限公司 51274
• 代理人: 馮龍;王記明

本發明公開了一種快速檢測IBV二溫式納米PCR試劑盒及應用，所述快速檢測IBV的二溫式納米PCR試劑盒包括：2×Nano buffer，Taq DNA聚合酶，10×loading buffer，根據IBV 3′端非編碼區保守區域設計的一對特異性引物，無陽性核酸ddH₂O以及陽性質粒；特異性引物的上游引物為：5′?GAGAGGAACAATGCACAGC?3′，下游引物為：5′?CATTTCCCTGGCGATAGAC?3′。本發明的IBV二溫式納米PCR試劑盒能提高了IBV檢測的靈敏度，靈敏度是傳統的PCR的100倍；以及縮短了反應時間28分鐘，且具有很好的特異性。

技術領域

本發明涉及分子生物學和養殖技術領域，具體涉及一種快速檢測IBV二溫式納米PCR試劑盒及應用。

背景技術

雞傳染性支氣管炎是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的一種急性高度接觸傳染性呼吸道疾病。雞傳染性支氣管炎主要侵害1～4周齡雛雞，臨床表現主要以氣管啰音、咳嗽、張口呼吸、產蛋下降等為特征，給養禽業帶來了巨大的經濟損失。目前常規檢測IBV技術主要有病毒分離、ELISA、RT-PCR技術和Real-time PCR技術等，但病毒分離和ELISA方法在快速、靈敏、特異以及操作要求上均存在某些不足。傳統RT-PCR方法近幾年來雖被廣泛應用，但靈敏度不高，且容易產生非特異性條帶，影響結果的觀察，擴增效率也有待提高。Real-time PCR靈敏度雖高且可以定量，但成本高且設備過于昂貴，不適合臨床推廣應用。因此如何提供一種高靈敏度和檢測時間縮短的快速檢測雞傳染性支氣管炎病毒的試劑盒是本領域技術人員有待解決的技術問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速檢測雞傳染性支氣管炎病毒的二溫式納米PCR試劑盒及其應用，為了實現本發明的目的，擬采用以下技術方案：

一種快速檢測IBV二溫式納米PCR試劑盒，所述該快速檢測IBV的二溫式納米PCR試劑盒包括：2×Nano buffer，Taq DNA聚合酶，10×loading buffer，根據IBV 3′端非編碼區保守區域設計的一對特異性引物，無陽性核酸ddH₂O以及陽性質粒；特異性引物的上游引物為：5′-GAGAGGAACAATGCACAGC-3′，下游引物為：5′-CATTTCCCTGGCGATAGAC-3′。

本發明還涉及上述快速檢測IBV的二溫式納米PCR試劑盒在制備檢測IBV試劑中的應用。

所述的一種快速檢測IBV二溫式納米PCR試劑盒，二溫式納米PCR試劑盒在制備檢測IBV中的應用，優化的實施方式中檢測IBV步驟包括以下：從病雞組織或含毒的尿囊液中提取病毒核酸，將病毒RNA反轉錄為cDNA，然后在二溫式納米PCR反應體系進行擴增目的片段，7μL納米PCR擴增產物與1μL 10×loading buffer液混合，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，試劑盒所帶的陽性質粒作為對照；其中二溫式納米PCR反應體系為：2×Nano buffer6μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，cDNA 1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，補足ddH₂O至12μL；擴增體系為：94℃預變性3分鐘；94℃變性15秒，57℃退火及延伸兩步共15秒，循環30次；最后72℃延伸3分鐘；整個擴增時間為37分鐘。傳統PCR的擴增體系為：94℃預變性3分鐘；94℃變性20秒，57℃退火20秒，72℃延伸30秒，循環35次；最后72℃延伸3分鐘，整個擴增時間為65分鐘。

本發明的快速檢測IBV二溫式納米PCR試劑盒，提高了IBV檢測的靈敏度，靈敏度是傳統的PCR的100倍；以及縮短了反應時間，變性時間均為15秒比傳統PCR的變性節約5秒；將傳統的退火和延伸兩個溫度合并為一個溫度為57℃，退火及延伸兩步能同時進行，時間共為15秒，比原來的退火時間20秒和延伸30秒共少了35秒；此外，二溫式納米PCR比傳統PCR擴增體系循環數少5個循環。二溫式納米PCR比傳統PCR擴增體系總反應時間快28分鐘；具有很好的特異性，在多種不同病毒干擾下，仍能特異檢測出IBV。