[發明專利]一種橡膠樹U6基因啟動子proHbU6.1及其克隆與應用

有效

• 申請號: 201910475737.1
• 申請日: 2019-05-31
• 公開（公告）號: CN110144355B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 辛士超;楊先鋒;范月婷;戴雪梅;華玉偉;黃華孫;王春;王克劍
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院橡膠研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京興智翔達知識產權代理有限公司 11768
• 代理人: 蔣常雪

1.一種橡膠樹U6基因啟動子proHbU6.1，其特征在于，所述啟動子proHbU6.1的DNA核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.一種橡膠樹瞬時轉化編輯載體，其特征在于，含有權利要求1所述的橡膠樹U6基因啟動子proHbU6.1。

3.根據權利要求2所述的橡膠樹瞬時轉化編輯載體，其特征在于，所述瞬時轉化編輯載體為重組質粒proHbU6.1-sgRNA-163Cas9M。

4.一種克隆權利要求1所述的橡膠樹U6基因啟動子proHbU6.1的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)以巴西橡膠樹熱研7-33-97葉片基因組DNA為模板，設計如下特異引物：

proHbU6.1-F：AGACAAGTGAGTGGATCGAGTC；

proHbU6.1-R：CAGCTCTGTTTCTTCTTGTTTTG；

(2)使用KOD FX酶在20μl反應體系中進行PCR擴增；

(3)將擴增產物TA克隆到pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌Dh5α中并挑重組單克隆測序，即得694bp橡膠樹U6基因啟動子DNA片段proHbU6.1。

5.根據權利要求4所述的克隆所述的橡膠樹U6基因啟動子proHbU6.1的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述PCR擴增步驟的反應程序為：95℃預變性2min，98℃變性10s，59℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環，72℃終延伸5min。

6.一種構建權利要求2或3所述的橡膠樹瞬時轉化編輯載體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(a)將克隆的啟動子proHbU6.1構建到中間載體SK-5G上

用SalI和XhoI雙酶切SK-5G載體，回收2913bp載體骨架片段，設計如下引物分別在proHbU6.1序列和載體gRNA序列兩端引入同源序列，將proHbU6.1和gRNA組裝到SK-5G載體上得到proHbU6.1-SK-5G：

proHbU6.1-lF：

GCGGCCGCAGATCTGCTAGCGTCGACAGACAAGTGAGTGGATCGAG；

proHbU6.1-lR：

GTGTTGTGTTCACCTGCGAGCCAGCTCTGTTTCTTCTTGTTTTG；

gRNA-sF：GCTCGCAGGTGAACACAACACC；

gRNA-sR：TTGGGTACCGAGGATCCTCTAGA；

(b)將靶位點構建到proHbU6.1-SK-5G載體上

在橡膠樹HbTFL1-3基因上選擇如下靶位點：

GCCCAGCATAGGGATCCAC，用AarI酶切proHbU6.1-SK-5G載體后兩端形成3’-CGAC和5’-GTTT兩個粘性末端；

合成靶位點序列，并引入5’-GCTG和3’-CAAA兩個粘性末端：

正向：GCTGGCCCAGCATAGGGATCCAC；

反向：AAACGTGGATCCCTATGCTGGGC；

將上述正向和反向靶點序列DNA混勻，100℃處理后進行室溫退火，形成帶有與proHbU6.1-SK-5G載體互補粘性末端的雙鏈DNA，然后使用T4 DNA連接酶將該片段連接到載體proHbU6.1啟動子下游位置得到完整sgRNA表達框；

(c)sgRNA表達框構建到瞬時轉化編輯載體163Cas9M上

用KpnI和BglII雙酶切proHbU6.1-sgRNA-SK-5G載體，回收843bp的小片段sgRNA表達框；

用KpnI和BamHI雙酶切163Cas9M載體，回收7919bp大片段；

使用T4 DNA連接酶將小片段sgRNA表達框構建到163Cas9M載體上得到橡膠樹瞬時轉化編輯載體proHbU6.1-sgRNA-163Cas9M，即得。

7.一種對橡膠樹進行基因組編輯的方法，其特征在于，包括將權利要求2或3所述的橡膠樹瞬時轉化編輯載體導入橡膠樹原生質體的步驟。