[發(fā)明專利]一種橡膠樹U6基因啟動子proHbU6.1及其克隆與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910475737.1
• 申請日: 2019-05-31
• 公開（公告）號: CN110144355B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 辛士超;楊先鋒;范月婷;戴雪梅;華玉偉;黃華孫;王春;王克劍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京興智翔達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11768
• 代理人: 蔣常雪

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種橡膠樹RNA聚合酶III型啟動子，更具體涉及一種橡膠樹U6基因啟動子proHbU6.1，并進一步公開其克隆方法與應(yīng)用。本發(fā)明首次在巴西橡膠樹中克隆獲得橡膠樹RNA聚合酶III型啟動子??橡膠樹內(nèi)源U6啟動子proHbU6.1，該啟動子為橡膠樹內(nèi)源RNA聚合酶III型啟動子，該啟動子具有高效轉(zhuǎn)錄活性，可驅(qū)動下游sgRNA的表達，并通過瞬時轉(zhuǎn)化橡膠樹原生質(zhì)體驗證了該啟動子的活性及其應(yīng)用于橡膠樹CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的可行性，并實現(xiàn)了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的橡膠樹基因組靶向編輯。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種橡膠樹RNA聚合酶III型啟動子，更具體涉及一種橡膠樹U6基因啟動子proHbU6.1，并進一步公開其克隆方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

天然橡膠一直是我國重要的戰(zhàn)略物資和儲備資源，目前，我國橡膠樹新品種的選育仍然是以傳統(tǒng)的雜交育種為主。由于橡膠樹生長緩慢，導(dǎo)致了常規(guī)育種存在效率低、周期長的問題，這嚴重地阻礙了橡膠樹育種的進程。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子育種技術(shù)在橡膠樹中的應(yīng)用加快了橡膠樹新品種的培育，通過農(nóng)桿菌或基因槍導(dǎo)入外源基因成為橡膠樹遺傳改良的重要方式。然而，在上述外源基因片段導(dǎo)入的過程中，基因片段是隨機地插入橡膠樹基因組的，不僅插入位點不受控制，同時還存在位置效益等問題(Yutaka等，2018，Chromosoma，doi:10.1007/s00412-018-0677-6.)。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated nuclease 9)基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)為基因組的精確修飾提供了新的途徑(Yongwei等，2016，F(xiàn)ront Plant Sci,7:1928；Collonnier等，2017，Methods,121-122:103-117；Yutaka等，2018，Chromosoma,doi:10.1007/s00412-018-0677-6)，其介導(dǎo)基因編輯的基本原理是依靠單鏈向?qū)NA(single guide RNA,sgRNA)引導(dǎo)下，利用核酸酶Cas9定點結(jié)合和切割基因組特異性位點(PAM)上游特定靶位點，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSBs)，進而引起靶位點的突變。同時，通過同源重組修復(fù)(HR)或非同源末端連接(NHEJ)生物內(nèi)源修復(fù)機制，也可將外源供體DNA插入到sgRNA靶位點，從而實現(xiàn)對基因組上特定位點的突變以及特定DNA片段的敲除、插入及替換等(Lee等，2017,Elife,6:e25312.；Smirnikhina等，2018，Hum Genet,138(1):1-19.)，并由此實現(xiàn)目標基因的精準化品種改良。目前，在擬南芥(Miki D等，2018,Nat Commun.9(1):1967.)、水稻(Li J等，2016,NatPlants,2(10):16139.)及玉米(Gil-Humanes J等，2017,Plant J,89(6):1251-1262.)等植物中已經(jīng)利用基于質(zhì)粒CRISRP/Cas9基因組編輯技術(shù)實現(xiàn)了外源基因的導(dǎo)入。此外，在玉米、小麥、水稻中也已經(jīng)通過CRISPR/Cas9-sgRNA RNP瞬時轉(zhuǎn)化也實現(xiàn)了外源基因的導(dǎo)入(Svitashev S等，2015,Plant Physiol,169(2):931-945.；Liang Z等，2017,Nat Commun,8:14261.；Sun Y W等，2016,Mol Plant,9(4):628-631)；另外，Liang等(2018，NatureProtocols,13(3):413-430.)也利用基因槍將Cas9和sgRNA表達載體質(zhì)粒，通過瞬時轉(zhuǎn)化受體細胞實現(xiàn)基因編輯。