[發明專利]一種制備桑青枯菌抗體的方法及其在DAS-ELISA檢測方法上的應用

在審

• 申請號: 201910475412.3
• 申請日: 2019-06-03
• 公開（公告）號: CN110386979A
• 公開（公告）日: 2019-10-29
• 發明（設計）人: 王俊;王金正;蘇佳威;盛晟;吳福安
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N15/06;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

一種制備桑青枯菌抗體的方法及其在DAS?ELISA檢測方法上的應用。以BALA/c小鼠為免疫動物，采用青枯菌活體菌株免疫，制備出抗青枯菌的單克隆抗體并用于構建青枯菌的DAS?ELISA檢測方法。使用菌懸液濃度為10⁶?10⁸CFU/mL的活體青枯菌菌懸液免疫小鼠，并篩選出雜交瘤細胞，制備桑青枯菌DAS?ELISA試劑盒，其中，0.1?10％的脫脂奶粉或僅含有蛋白的藥劑如牛血清白蛋白作為封閉液，TMB顯色液時間為10?60min，辣根過氧化氫酶標記的抗體作用時間為10?60min，辣根過氧化氫酶標記的抗體稀釋倍數為1:100?1:5000,捕獲抗體稀釋倍數為1:100?1:5000。本技術對桑青枯菌具有良好的檢測靈敏度最低檢測限為3.13×10³CFU/mL，可實現在2.5h內對桑青枯菌的檢測，且操作簡便，檢測快速。

技術領域

本發明屬于生物技術和免疫學領域，具體涉及一種制備桑青枯菌單克隆抗體的方法及其在DAS-ELISA檢測方法上的應用。

背景技術

青枯菌，即青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)，是導致植物細菌性萎蔫(青枯病) 的主要植物病原物之一。青枯菌可侵染50科500多種作用，位于植物病害中世界上公認最具危害性病原菌排行版的第二位。在我國就有將近30個省份有報道青枯病病害，主要危害植物為馬鈴薯、番茄、花生、茄子、生姜、辣椒等眾多農作物，桑樹、煙草等經濟作物和部分名貴中藥材，對于我國農業生產及蠶桑產業發展造成重大危害，因此若能夠對青枯菌進行及時的檢測，將為保障農業生產和蠶桑產業爭取寶貴的時間。

目前，對于此類病原菌的檢測方式主要是基于PCR技術的檢測方法，以青枯菌的特異性核酸序列或特殊蛋白作為靶標，建立靶標物質濃度與青枯菌菌種濃度間的數量關系，以此來對青枯菌菌種數量進行間接性的檢測。此類方法需要使用到類似PCR儀等復雜儀器，并且操作較為復雜，對檢測條件要求較高，因此，在農業生產中推廣受到限制，不利于對現場樣品進行檢測，檢測時效性難以保障。

現有技術中如Said等(Microb Pathogenesis，2018,115:216-221.)的研究工作中，采用青枯勞爾氏菌屬中3號生理種2號生化型對新西蘭白兔進行免疫，并以此制備出免疫血清獲取兔源多克隆抗體，用于構建對青枯菌3號生理種2號生化型的間接ELISA檢測方法，檢測時間為3h且最低檢測限為10⁶CFU/mL。采用活體菌株對動物免疫并制備抗體具有良好的可行性，但由于Said等的研究中所構建的間接ELISA方法所使用的抗體為多克隆抗體，存在特異性方面的問題導致檢測靈敏度收到影響。

酶聯免疫吸附測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，最早出現于Engvall 等(Immunochemistry，1971,8(9):871-874.)利用該法定量測定免疫球蛋白的研究，主要利用免疫學中抗體抗原結合的特異性反應對靶標物質進行特異性識別，以及酶催化反應的高效性來將特異性識別信號通過催化反應表現出來，通過肉眼或者分光光度計進行定量檢測分析。 Zhang等(Anal Chem，2014,86(2):1115-1122.)基于漆酶根據ELISA原理設計出用于檢測大腸桿菌O157:H7的體系，以磁性納米粒作為負載有捕獲抗體的固定相，兔源多克隆抗體作為捕獲抗體，用于特異性捕獲大腸桿菌，生物素標記后的鼠源單克隆抗體作為標記抗體，利用葡萄糖氧化酶催化反應中產生的H₂O₂在漆酶的催化下與魯米諾產生化學發光反應，通過以上方式完成對大腸桿菌的富集與檢測信號放大。該體系對大腸桿菌O157:H7的最低檢測限為1.2 ×10³CFU/mL，且檢測時間小于2h，已成功用于泉水、蘋果汁和脫脂牛奶等樣品檢測。綜上，基于免疫學與血清學的ELISA檢測技術具有較高的靈敏度以及較短短的檢測時間，有望將其應用于田間樣品中青枯菌的檢測分析中。