[發明專利]一種制備桑青枯菌抗體的方法及其在DAS-ELISA檢測方法上的應用

在審

• 申請號: 201910475412.3
• 申請日: 2019-06-03
• 公開（公告）號: CN110386979A
• 公開（公告）日: 2019-10-29
• 發明（設計）人: 王俊;王金正;蘇佳威;盛晟;吳福安
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N15/06;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

1.一種制備桑青枯菌抗體的方法，其特征在于，以菌懸液濃度為10⁶-10⁸CFU/mL的活體青枯菌菌懸液作為免疫抗原，對小鼠免疫處理后，取達到10000以上效價后的小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行細胞融合，篩選出分泌抗體蛋白的雜交瘤細胞，并對抗體蛋白進行純化處理，即得桑青枯菌抗體9G9、1G9和2H5。

2.根據權利要求1所述制備桑青枯菌抗體的方法，其特征在于，所述青枯菌為ATCC-BAA1114、GIM1.76、GIM1.74、GIM1.71或GIM1.73。

3.基于權利要求1所述的制備桑青枯菌抗體在DAS-ELISA檢測方法上的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，將稀釋倍數為1:100-1:5000的桑青枯菌抗體預先包被在酶標板上，使用0.1-10％的脫脂奶粉或僅含有蛋白的藥劑作為封閉液對酶標板進行封閉處理，加入樣品溶液或標準品后，再加入稀釋倍數為1:100-1:5000的辣根過氧化氫酶標抗體，作用時間為10-60min，所述辣根過氧化氫酶標抗體為結合有辣根過氧化氫酶的桑青枯菌抗體，樣品或標準品中的青枯菌與酶標板上的捕獲抗體相結合，形成“捕獲抗體-青枯菌-酶標抗體”復合物，經過TMB顯色液顯色10-60min后形成視覺可見的黃色物質，從而判斷樣品中是否含有青枯菌，采用酶標儀在450nm下測定吸光值，設置青枯菌培養液為陰性對照(Negative，N)，樣品吸光值為樣品檢測值(Positive，P)；P/N≥2時，判定為陽性；P/N介于1-2時，判定為弱陽性；P/N≤1時，判定為陰性。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述用于包被的桑青枯菌抗體稀釋倍數為1:1000。

6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述藥劑為牛血清白蛋白。

7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述TMB顯色液時間為30min。

8.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述辣根過氧化氫酶標抗體作用時間為60min。

9.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述辣根過氧化氫酶標抗體稀釋倍數為1:500。

10.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，最低檢測限為3.13×10³CFU/mL。