[發(fā)明專利]雞骨香揮發(fā)油抗腫瘤活性及其相關(guān)機制的測試方法及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910472431.0
• 申請日: 2019-05-31
• 公開（公告）號: CN110208515A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉超;孫金月;張瑞瑞;王青;程安瑋;王新坤;郭溆
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N33/535;G01N33/533;G01N33/569;G01N33/574
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11562
• 代理人: 牟炳彥

1.一種雞骨香揮發(fā)油抗腫瘤活性及其相關(guān)機制的測試方法，其特征在于，所述雞骨香揮發(fā)油抗腫瘤活性及其相關(guān)機制的測試方法包括：

第一步，細(xì)胞凋亡檢測，采用膜聯(lián)蛋白V-FITC /碘化丙啶試驗測定細(xì)胞凋亡；

第二步，Hoechst 33258染色，檢測凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)評估；

第三步，吖啶橙/溴化乙錠染色，進行細(xì)胞死亡檢測；

第四步，線粒體膜電位染色，采用JC-1檢測試劑盒檢測線粒體膜電位的變化；

第五步，活性氧種類測定，通過2,7-二氯熒光素二乙酸酯氧化敏感性熒光探針評估ROS的產(chǎn)生；

第六步，實時熒光定量PCR分析，使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，隨后進行PCR反應(yīng)；

第七步，蛋白質(zhì)印跡分析，并通過Image J軟件對目的蛋白條帶進行灰度分析；

第八步，統(tǒng)計分析，使用t檢驗進行數(shù)據(jù)組之間的差異檢測。

2.如權(quán)利要求1所述的雞骨香揮發(fā)油抗腫瘤活性及其相關(guān)機制的測試方法，其特征在于，第一步， 細(xì)胞凋亡檢測包括：用0,15,25,35 μg/ mL不同濃度的雞骨香揮發(fā)油處理A549細(xì)胞48小時；將細(xì)胞消化并重懸浮于膜聯(lián)蛋白V-FITC結(jié)合緩沖液中，加入膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI試劑，并在室溫下避光孵育；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測染色的細(xì)胞。

3.如權(quán)利要求1所述的雞骨香揮發(fā)油抗腫瘤活性及其相關(guān)機制的測試方法，其特征在于，第二步，Hoechst 33258染色包括：將細(xì)胞接種在12孔板中用0,15,25,35 μg/ mL不同濃度的雞骨香揮發(fā)油處理細(xì)胞48小時；將細(xì)胞用4％多聚甲醛固定15分鐘；用PBS洗滌兩次后，用Hoechst 33258將細(xì)胞染色；并分析細(xì)胞核的形態(tài)變化。

4.如權(quán)利要求1所述的雞骨香揮發(fā)油抗腫瘤活性及其相關(guān)機制的測試方法，其特征在于，第三步，吖啶橙/溴化乙錠染色包括：

將A549細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板中；并用含有0,15,25,35 μg/ mL不同濃度雞骨香揮發(fā)油處理48小時后，將1mL、濃度100 μg/ mL 的AO / EB染色加入到每個孔中，避光孵育，檢測染色的細(xì)胞。

5.如權(quán)利要求1所述的雞骨香揮發(fā)油抗腫瘤活性及其相關(guān)機制的測試方法，其特征在于，第四步，線粒體膜電位染色包括：

細(xì)胞接種在6孔板用0 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL和35 μg/mL雞骨香揮發(fā)油處理細(xì)胞48小時，加入JC-1試劑，并檢測結(jié)果。

6.如權(quán)利要求1所述的雞骨香揮發(fā)油抗腫瘤活性及其相關(guān)機制的測試方法，其特征在于，第五步，活性氧種類測定包括：接種在6孔板用0, 15 μg/mL,25 μg/mL和35 μg/mL雞骨香揮發(fā)油處理細(xì)胞48小時；加入MDCFH-DA試劑溫育30分鐘；用熒光分光光度計檢測細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光，激發(fā)= 488 nm；發(fā)射=521 nm；

第六步，實時熒光定量PCR分析包括：使用SYBR Premix ExTaq II在AppliedBiosystems 7500實時PCR系統(tǒng)上進行qPCR；

第七步，蛋白質(zhì)印跡分析包括：用CCEO處理后收集細(xì)胞，并在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解；將40-60 μg目的蛋白上樣于10-12％SDS-PAGE膠中進行電泳后并轉(zhuǎn)移至PVDF膜；將膜于5％脫脂牛奶中在室溫下封閉1小時；然后，將膜與特定目標(biāo)抗體一起孵育4°C過夜，用TBST洗滌，然后與HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2小時，隨后將ECL發(fā)光劑混合液加入到PDVF膜上，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進行掃膜顯影。

7.一種利用權(quán)利要求1所述雞骨香揮發(fā)油抗腫瘤活性及其相關(guān)機制的測試方法測定的雞骨香揮發(fā)油。