[發(fā)明專利]一種O抗原親和介質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201910471792.3 | 申請(qǐng)日： | 2019-05-31 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN110172087B | 公開(kāi)（公告）日： | 2021-05-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 張松平;蘇志國(guó);楊延麗;尤星力 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所 |
| 主分類號(hào)： | C07K14/255 | 分類號(hào)： | C07K14/255;B01J20/286;B01J20/30;B01D15/38;C07K16/12;G01N33/543;G01N33/569 |
| 代理公司： | 北京品源專利代理有限公司 11332 | 代理人： | 鞏克棟 |
| 地址： | 100190 北京市海淀區(qū)中關(guān)村*** | 國(guó)省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 抗原 親和 介質(zhì) 及其 制備 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種O抗原親和介質(zhì)，其特征在于，所述O抗原親和介質(zhì)包括超大孔介質(zhì)和沙門(mén)氏菌的O抗原，所述O抗原化學(xué)固定在超大孔介質(zhì)表面；
所述沙門(mén)氏菌包括雞白痢沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌或豬傷寒沙門(mén)氏菌中的任一種或至少兩種的組合；
超大孔介質(zhì)的基質(zhì)為聚苯乙烯；
所述超大孔介質(zhì)的孔徑為200-400nm；
所述O抗原的分子量范圍為5-800kDa。
2.一種如權(quán)利要求1所述的O抗原親和介質(zhì)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)提取沙門(mén)氏菌的O抗原；
(2)采用環(huán)氧氯丙烷對(duì)超大孔介質(zhì)進(jìn)行環(huán)氧活化；
(3)O抗原配基接枝。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述提取的方法為酸水解法；
所述酸水解法包括如下步驟：
(a1)將菌體以1:(8-12)的體積比加入0.8％～1.0％(w/v)的氯化鈉溶液重懸菌體，混勻后加入0.8％-1％(v/v)的乙酸，使溶液最終的pH為3.5-4.7，于100℃下煮沸5-8h，結(jié)束后用28％的NH4OH進(jìn)行中和，使得最終pH為6-7，最后離心獲取上清；
(b1)在步驟(a1)所得的上清中加入pH 2.5-3.0檸檬酸緩沖液至最終濃度為10-30mM，接著在室溫下放置25-35min，通過(guò)離心棄去沉淀得到上清液；
(c1)在步驟(b1)所得上清液中分別加入Na2HPO4、甲醇和CaCl2，至最終濃度分別為15-20mM、20-26％和180-220mM，在室溫下混勻并靜置25-35min，然后離心棄去沉淀得到上清液；
(d1)將步驟(c1)所得上清液-80℃中冷凍后進(jìn)行凍干。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述環(huán)氧活化包括如下步驟：
(a2)用20％-70％的二甲基亞砜清洗抽干后的超大孔介質(zhì)微球；
(b2)依次加入環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉、超純水，使環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉終濃度分別為8-12％(w/v)和0.6-1.0M，將含有介質(zhì)的懸浮液置于恒溫空氣浴搖床上在170r/min下振蕩反應(yīng)2-3h，反應(yīng)溫度為35-45℃；
(c2)依次用異丙醇及去離子水沖洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述配基接枝包括如下步驟：
(a3)稱取O抗原凍干粉按照(8-14):1(w/v)的比例溶解于0.2M氫氧化鈉溶液中；
(b3)按照(3-5):10(w/v)的比例加入帶有環(huán)氧基的活化的超大孔介質(zhì)，置于恒溫空氣浴搖床上在35-45℃振蕩反應(yīng)20-26h。
6.一種如權(quán)利要求1所述的O抗原親和介質(zhì)在沙門(mén)氏菌O抗原特異性抗體純化分離中的應(yīng)用。
7.一種如權(quán)利要求1所述的O抗原親和介質(zhì)純化O抗原特異性抗體的方法，其特征在于，包括如下步驟：
1)平衡：平衡緩沖液濃度為10-50mM磷酸緩沖液，pH6.5-7.5，含50-100mM氯化鈉；
2)吸附：將含多克隆抗體的樣品換液至10-50mM磷酸緩沖液，pH6.5-7.5，含50-100mM氯化鈉的緩沖液中，與親和層析介質(zhì)通過(guò)靜態(tài)吸附或者層析柱吸附；
3)洗脫：采用pH2.5-3.0，5-15mM的檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，即為含O抗原特異性抗體的收集液。
8.一種如權(quán)利要求7所述的方法純化得到的O抗原特異性抗體。
9.一種如權(quán)利要求8所述的O抗原特異性抗體在制備診斷沙門(mén)氏菌的試劑和/或試劑盒中的應(yīng)用。
10.一種非診斷目的的檢測(cè)沙門(mén)氏菌的ELISA方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求8所述O抗原特異性抗體吸附在固相載體表面的步驟。
11.一種膠體金試劑卡，其特征在于，所述試劑卡包被如權(quán)利要求8所述O抗原特異性抗體。
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