[發明專利]一種檢測少量全血樣品中維生素B1三種標志物的方法

在審

• 申請號: 201910463571.1
• 申請日: 2019-05-30
• 公開（公告）號: CN112014486A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 黃以超;陳達;劉戈
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙) 44248
• 代理人: 謝肖雄

本發明涉及一種簡單可靠的檢測少量全血樣品中維生素B1三種標志物的方法，包括以下步驟：步驟I、樣品的保存處理；步驟II、樣品前處理中的除蛋白以及萃取目標化合物；步驟III、樣品前處理中的衍生化步驟；步驟IV、樣品上樣之前的pH調節；步驟V、高效液相UPLC的分析與定量；其中，所述的樣品為保存于抗凝管中的全血樣品，可使用經過EDTA或者肝素抗凝處理的血樣，用于人群分析以及臨床試驗的維生素B1營養成分的測定，其使用樣品量低、簡單靈敏，特異型強、重復性好、穩定性好、且所需成本較低。

技術領域

本發明屬于血液檢測方法技術領域，具體涉及一種檢測少量全血樣品中維生素B1三種標志物的方法。

背景技術

作為一種水溶性的維生素，維生素B1又稱硫胺素，其作為一種必須營養物質在能量的產生和代謝過程中起著重要的作用。維生素B1的缺乏常見的會導致腳氣病、視神經病變以及其他增加嬰兒死亡率的相關疾病。因此準確了解高危人群(如東南亞及其他欠發達地區，包括中國)的維生素B1的水平對于人群調查以及臨床試驗有著總要的意義。鑒于人群調查等質的研究常常涉及到大數量、有限的血液體積的隊列樣品，因此如何在較低成本下準確從較少量的樣品中檢測維生素B1具有重要實踐意義。

維生素B1在血液中的存在主要是以硫胺素二磷酸TDP(亦稱為硫胺素焦磷酸TPP)為主要成分，約占80％-90％的總B1濃度。而根據發明人的調研發現目前國內已申報的專利中，針對B1水平的檢測主要集中在標志物中的硫胺素Th(約占總B1的5％)因此無法準確評價病人的B1的真實水平。而縱觀英文科研文獻中對于維生素B1的檢測方法的報道中普遍忽略樣品用量的降低、方法成本以及方法是否可以長期穩定可靠的檢測問題。例如樣品保存、除蛋白、進樣前樣品的處理以保護色譜柱等等重要細節問題，這些過程的優化可以為準確的輸出可靠的結果、降低成本提供了保障。

發明內容

針對背景技術中存在的技術缺陷，本發明的目的為克服上述現有的技術不足而開發一種同時檢測維生素B1三種重要的標志物(Th、TMP以及TDP)，并通過優化使用低樣品量、低成本的穩定可靠的基于高效液相的分析方法。為實現上述目的，主要包括以下步驟：

一種檢測少量全血樣品中維生素B1三種標志物的方法，包括以下步驟：

步驟I、樣品的保存處理；

步驟II、樣品前處理中的除蛋白以及萃取目標化合物；

步驟III、樣品前處理中的衍生化步驟；

步驟IV、樣品上樣之前的pH調節；

步驟V、高效液相UPLC的分析與定量；

其中，所述的樣品為保存于抗凝管中的全血樣品，可使用經過EDTA或者肝素抗凝處理的血樣。

作為本發明進一步的實施方式，所述步驟I中樣品的保存處理操作為，經過-80℃深度冷凍24h的50μL的樣品。

作為本發明進一步的實施方式，所述步驟II中樣品的除蛋白及萃取操作為，將經過步驟I處理后的樣品添加10％三氯乙酸并經過立即渦旋以防紅細胞迅速凝結成塊而降低萃取效率，然后萃取，待萃取后使用經水飽和的甲基叔丁基醚清洗。

作為本發明進一步的實施方式，所述步驟III中樣品的衍生化處理操作為，將經過步驟II處理后的樣品添加1mmol/L鐵氰化鉀的15％氫氧化鈉溶液。

作為本發明進一步的實施方式，所述步驟IV中樣品上樣前的pH調節操作為，添加3mol/L的磷酸將經過步驟III處理后樣品的pH調至8-10，并加入13μL甲醇以增加衍生化產物硫色素在檢測器下的信號強度。

作為本發明進一步的實施方式，所述步驟V中高效液相UPLC分析的操作為，使用超高液相體系配備C18色譜柱以及熒光檢測器FLD。