[發(fā)明專利]RFP標記小細胞肺癌細胞系及其建立和應用

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• 申請日: 2019-05-30
• 公開（公告）號: CN110157684A
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發(fā)明（設計）人: 盧紅陽;姜志明;劉小珍
• 申請（專利權）人: 浙江省腫瘤醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12Q1/02
• 代理公司: 上海精晟知識產(chǎn)權代理有限公司 31253
• 代理人: 周麗娟

1.一種RFP標記小細胞肺癌LTEP-P細胞系，其特征在于，是以小細胞肺癌LTEP-P細胞株為母細胞，轉(zhuǎn)染包裝有RFP的pLEIN逆轉(zhuǎn)錄病毒，再經(jīng)G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定持續(xù)表達紅色熒光蛋白的小細胞肺癌LTEP-P細胞系。

2.如權利要求1所述RFP標記小細胞肺癌LTEP-P細胞系的建立方法，其特征在于，包括：

將包裝細胞PT67與含RFP基因的pLEIN質(zhì)粒共培養(yǎng)以轉(zhuǎn)染包裝細胞PT67，再經(jīng)G418抗性篩選，獲得產(chǎn)病毒RFP陽性細胞克隆；

用所述產(chǎn)病毒RFP陽性細胞克隆轉(zhuǎn)染小細胞肺癌LTEP-P細胞株，再經(jīng)G418抗性篩選，獲得所述RFP標記小細胞肺癌LTEP-P細胞系。

3.如權利要求2所述的建立方法，其特征在于，包括：

(1)將包裝細胞PT67培養(yǎng)至70％-80％匯合度時，與轉(zhuǎn)染試劑和含RFP基因的pLEIN質(zhì)粒充分浸潤，在室溫共同混合孵育18小時后，置37℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)48小時，再轉(zhuǎn)入含200～1000μg/ml G418的RPMI 1640培養(yǎng)液中置于37℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)7天，然后，轉(zhuǎn)入含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中并置于37℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)18小時，得到含病毒載體的細胞上清液；

(2)分離步驟(1)所得的細胞上清液，并收集其中的病毒載體進行滴度測定，確定最佳病毒感染濃度，相應的細胞上清液待用；

(3)小細胞肺癌LTEP-P細胞生長至對數(shù)期時，用步驟(2)所確定的具有最佳病毒感染濃度的細胞上清液與RPMI 1640培養(yǎng)液按照1:1的體積比混合，共培養(yǎng)72小時；72小時后胰酶消化，1:1傳代培養(yǎng)于含200μg/ml G418的RPMI 1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過程中G418濃度逐步提高到800μg/ml；用克隆環(huán)分離表達RFP的克隆細胞，在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中置于37℃、5％CO₂、飽和濕度中培養(yǎng)擴增，收集LTEP-P-RFP腫瘤細胞。

4.如權利要求3所述的建立方法，其特征在于，步驟(1)中，所述轉(zhuǎn)染試劑為N-[1-(2,3-二油酰基)]-N,N,N-三甲胺丙烷甲基硫酸鹽。

5.如權利要求1所述RFP標記小細胞肺癌LTEP-P細胞系的應用。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，為所述RFP標記小細胞肺癌LTEP-P細胞系用于在裸鼠中產(chǎn)生小細胞肺癌瘤塊。

7.如權利要求5所述的應用，其特征在于，為所述RFP標記小細胞肺癌LTEP-P細胞系在建立小細胞肺癌裸鼠模型中的應用。

8.如權利要求5所述的應用，其特征在于，為RFP標記小細胞肺癌LTEP-P細胞系在作為小細胞肺癌發(fā)生、小細胞肺癌發(fā)展或小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的細胞模型中的應用。

9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，為RFP標記小細胞肺癌LTEP-P細胞系在作為小細胞肺癌特異胸腔內(nèi)轉(zhuǎn)移的細胞模型中的應用。

10.如權利要求5所述的應用，其特征在于，為所述RFP標記小細胞肺癌LTEP-P細胞系在研究小細胞肺癌發(fā)生機理、耐藥機理或篩選治療小細胞肺癌藥物中的應用。